中海拔地區(qū)不同暴露時(shí)間下大鼠肝臟組織脂肪酸代謝相關(guān)指標(biāo)變化

保積英，任明

1青海大學(xué)研究生院，西寧810016；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科

機(jī)體的脂肪酸代謝在缺氧適應(yīng)中起重要作用。脂肪酸對(duì)碳水化合物起重要的補(bǔ)充作用[1]。肝臟作為能量代謝的關(guān)鍵器官，可表達(dá)豐富參與脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子及酶類。低氧下肝臟中參與脂肪酸代謝的相關(guān)基因呈差異性表達(dá)[2]。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是缺氧應(yīng)激的主要感受器，在能量下降的適應(yīng)性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。研究證實(shí)，低氧應(yīng)激通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)下游靶蛋白，維持機(jī)體能量平衡。乙酰輔酶A羧化酶1(ACC-1)與肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT-1)分別為脂肪酸合成與氧化的限速酶[3-4]。在低氧環(huán)境下參與脂肪酸代謝的相關(guān)蛋白主要受到海拔高度及暴露時(shí)間的影響。2019年1月—2021年7月，本研究通過動(dòng)態(tài)測(cè)定中海拔地區(qū)(西寧地區(qū))大鼠肝臟組織中參與肝臟脂肪酸代謝相關(guān)指標(biāo)的水平變化，探討中海拔地區(qū)不同暴露時(shí)間下肝臟脂肪酸代謝特點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康成年SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量168～206 g，購(gòu)于西安站夢(mèng)生物科技有限公司。酶標(biāo)儀、PCR儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能有限公司。漩渦混合器購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。real-time PCR儀購(gòu)自ABI公司。電泳儀購(gòu)自北京六一公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。大鼠酮體(KB)、游離脂肪酸(NEFA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司。重組Anti-CPT1A抗體、山羊抗兔IgG H&L、重組Anti-Acetyl Coenzyme A Carboxylase抗體、Anti-AMPK抗體、Anti-HIF-1α抗體購(gòu)自Abcam公司。β-actin Loading Control antibody Mouse MAb購(gòu)自義翹神州有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理 SD大鼠60只，根據(jù)飼養(yǎng)環(huán)境不同分為對(duì)照組、1 d組、3 d組、7 d組、15 d組、30 d組各10只，對(duì)照組在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房(海拔400 m)飼養(yǎng)30 d；1 d組、3 d組、7 d組、15 d組、30 d組分別在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房(海拔2 260 m)飼養(yǎng)1、3、7、15、30 d。各組大鼠居住和飲食條件均一致，室溫25 ℃，空氣流通，攝食及飲食自由，有專業(yè)人員給予定期消毒，飼養(yǎng)過程中無(wú)動(dòng)物死亡。飼養(yǎng)的各環(huán)節(jié)均遵循各動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心要求。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照國(guó)家衛(wèi)生部動(dòng)物管理?xiàng)l例進(jìn)行。大鼠分別在達(dá)到實(shí)驗(yàn)規(guī)定的暴露時(shí)間后，給予水合氯醛腹腔注射麻醉，從心臟抽取血液4 mL于抗凝管內(nèi)，用低溫高速離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，取上清液于凍存管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱內(nèi)；隨后取大鼠適量肝臟組織置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血漿ALT、NEFA及肝臟組織中KB測(cè)定 采用ALT試劑盒、KB試劑盒和NEFA試劑盒分別檢測(cè)血漿中的ALT、NEFA及肝臟組織中的KB，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.4 肝臟組織中AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA及蛋白檢測(cè)

1.4.1 AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA檢測(cè) 將肝臟組織在液氮急速冷凍后研磨成粉，取50 mg加入含有TRIzol試劑1 mL的離心管中，混勻，室溫放置15 min以上。加入200 μL的氯仿，顛倒混勻后室溫放置5 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清至新的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，-20 ℃放置60 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min去上清液。加入75%乙醇洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心15 min去上清液，用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。取總RNA 800 ng，加入1 μL引物(0.1 μg/μL)、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript@RT/RI Enzyme Mix、1 μL TransScript@RT/RI Enzyme Mix、加RNase-free水至總體積為20 μL。輕輕混勻，25 ℃反應(yīng)10 min，85 ℃反應(yīng)5 s取出。將合成cDNA置于-80 ℃保存，后續(xù)熒光定量檢測(cè)的樣本cDNA使用RNase-free Water按照1∶1稀釋進(jìn)行反應(yīng)。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系包括Evagreen 2×qPCR Master Mix(10 μL)、上下游引物(各0.6 μL)、cDNA(2.0 μL)、無(wú)RNA酶水(6.8 μL)。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃，5 s，40個(gè)循環(huán)；退火/延伸60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 待測(cè)基因引物序列

1.4.2 AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白檢測(cè) 肝臟組織樣本研磨后，取100 mg加入到預(yù)冷的1.5 mL離心管中，加入400 μL RIPA裂解液，充分混勻，4 ℃放置60 min后，4 ℃下12 000 r/min離心15 min收集上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣本加入適量5×SDS-PAGE Loading buffer(含β-巰基乙醇)，100 ℃沸水加熱處理5 min，使蛋白充分變性，12 000 r/min離心5 min，取上清備用。預(yù)染蛋白Marker 9 μL，樣品每孔上樣蛋白50 μg。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜時(shí)采用恒壓轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，使用0.45 μm的PVDF膜。AMPK、β-actin(內(nèi)參)轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，CPT-1、HIF-1α轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min，ACC-1轉(zhuǎn)膜時(shí)間為150 min。使用含5%脫脂奶粉的封閉液，封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，然后TBST洗3次，一次5 min。加一抗4 ℃孵育過夜后加入二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次，將顯色液A液和B液混合，加2 mL至膜上，用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照。使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿ALT、NEFA及肝臟組織中KB水平比較 各組血漿ALT、NEFA及肝臟組織中KB水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 血漿ALT、NEFA及肝臟組織中KB水平比較

2.2 各組肝臟組織中AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組肝臟組織中AMPK mRNA表達(dá)量高于1 d組、3 d組、7 d組、15 d組和30 d組(P均<0.05)。15 d組ACC-1、CPT-1 mRNA表達(dá)量最低，30 d組ACC-1、CPT-1 mRNA表達(dá)量升高至對(duì)照組水平；1 d組、3 d組、7 d組、15 d組HIF-1α mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，30 d組降低至對(duì)照組水平。見表3。對(duì)照組與1 d組AMPK蛋白表達(dá)高于3 d組、7 d組、15 d組、30 d組(P均<0.05)；3 d組ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組、1 d組、7 d組、15 d組、30 d組(P均<0.05)。見表4。

表3 各組肝臟組織中AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α mRNA表達(dá)比較

表4 各組肝臟組織中AMPK、ACC-1、CPT-1、HIF-1α蛋白表達(dá)比較

3 討論

高原低氧習(xí)服是機(jī)體為了適應(yīng)高原低氧低壓環(huán)境而發(fā)生的一系列非遺傳的、可逆的代償性變化[5]。目前國(guó)內(nèi)外研究多集中于高原習(xí)服過程中能量代謝模式的轉(zhuǎn)變[6-8]，發(fā)現(xiàn)氧氣利用率更高以適應(yīng)低氧環(huán)境。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)急性(<3 d)暴露于中海拔地區(qū)，ACC-1、CPT1 mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)隨著HIF-1α mRNA表達(dá)的增加呈現(xiàn)一過性增加，表明可能在急性暴露早期，脂肪酸合成及氧化代謝短暫性增強(qiáng)，但是隨著機(jī)體逐漸產(chǎn)生習(xí)服，兩者均逐漸降低，直至慢性暴露期一直維持接近對(duì)照組的水平，但在暴露全程中NEFA及KB水平未見明顯變化。

有學(xué)者研究顯示，慢性高原暴露(4 300 m，8周)高脂飲食組與高原暴露正常飲食組的大鼠肝臟組織磷酸化AMPK表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而與非高原暴露高脂飲食組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明低氧環(huán)境下會(huì)激活A(yù)MPK的活性[9-10]。AMPK激活機(jī)制主要包括以下方面：增多的AMP/ATP與AMPK的γ亞基結(jié)合使其發(fā)生構(gòu)象改變，激活A(yù)MPK；增多的AMP促進(jìn)AMPK上游激酶肝激酶B1，直接磷酸化AMPK[11]；AMP結(jié)合引起構(gòu)象變化，該構(gòu)象變化抑制蛋白磷酸酶對(duì)磷酸化AMPKα(Thr172位點(diǎn))抗體的去磷酸化作用；通過上游激酶鈣調(diào)蛋白依賴性激酶β的磷酸化作用激活A(yù)MPK。另外，由于上游激酶在不同組織的分布差異，使得AMPK活性的調(diào)節(jié)可能因組織不同而不同[10]。本研究結(jié)果僅顯示AMPK mRNA及蛋白持續(xù)低表達(dá)，而對(duì)于AMPK的磷酸化水平未予以評(píng)估。

AMPK下游靶蛋白ACC-1大量表達(dá)于肝臟，可將乙酰CoA催化為丙二酰輔酶A，進(jìn)一步合成脂肪酸。激活的AMPK通過磷酸化及基因表達(dá)調(diào)控ACC-1抑制脂肪酸合成代謝[12]。本研究結(jié)果顯示，在急性暴露早期，ACC-1蛋白表達(dá)明顯增加，而AMPK蛋白表達(dá)顯著降低；隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，7 d時(shí)ACC-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異，即從暴露第7天到第30天恢復(fù)到非暴露組水平，提示肝臟脂肪酸合成代謝一過性增強(qiáng)。但AMPK一直呈低表達(dá)，提示ACC-1還受到其他系統(tǒng)的調(diào)控。

CPT1是長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的限速酶。在低氧應(yīng)激下，CPT1活性主要受脂肪酸合成中間產(chǎn)物丙二酰輔酶A調(diào)節(jié)，后者競(jìng)爭(zhēng)性抑制CPT1的活性，從而抑制脂酰CoA進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化。酮體是肝臟中氧化分解的中間產(chǎn)物，肝臟具有較強(qiáng)的合成酮體的酶系，合成原料為脂肪酸β氧化產(chǎn)生的乙酰CoA，可用于評(píng)估脂肪酸氧化水平。本研究結(jié)果顯示，CPT1蛋白表達(dá)水平在暴露早期顯著增加，之后逐漸恢復(fù)，而肝酮體含量在整個(gè)暴露期與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化，提示中海拔地區(qū)由于低氧狀態(tài)很快被糾正，肝臟脂肪酸氧化代謝增強(qiáng)的持續(xù)時(shí)間短暫，并且程度較弱。

低氧環(huán)境下這類研究有很多。一項(xiàng)模擬低氧的研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚在急性低氧應(yīng)激(96 h內(nèi))條件下，肝臟對(duì)脂質(zhì)利用沒有顯著變化[13]。在人類腫瘤(相對(duì)缺氧環(huán)境)如腎透明細(xì)胞癌中，CPT1的表達(dá)和活性均低于正常腎臟[14]。在胃腺癌組織中，CPT1A基因表達(dá)下調(diào)，且CPT1A的表達(dá)降低與HIF-1α表達(dá)上調(diào)相關(guān)[15]?？紤]到高原通常還伴有低溫，一項(xiàng)冷缺氧相關(guān)研究[模擬海拔6 096 m、溫度(10±1)℃]結(jié)果顯示，暴露1 d和暴露7 d大鼠的肌肉和肝臟中CPT1表達(dá)顯著減少，認(rèn)為脂肪酸代謝、氧化代謝水平降低可能是動(dòng)物低代謝狀態(tài)的原因[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，將肝細(xì)胞暴露于1% O2可降低CPT1 mRNA表達(dá)，抑制氧化代謝，誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪積聚，而對(duì)脂肪酸的合成無(wú)顯著影響[17]。本研究結(jié)果提示，在低氧急性暴露下，參與脂肪酸合成與氧化的關(guān)鍵酶表達(dá)均增加，但由于缺氧狀態(tài)很快被糾正(HIF-1α很快恢復(fù)到非暴露水平)，持續(xù)時(shí)間短暫，隨后恢復(fù)到對(duì)照組水平。由此可見，低氧環(huán)境下脂肪酸代謝復(fù)雜多變，除了不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)導(dǎo)致的結(jié)果差異外，在同一海拔的不同季節(jié)、不同性別研究對(duì)象也具有不同代謝特點(diǎn)[14,16-18]。

有部分研究支持本研究結(jié)果。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在慢性暴露于高海拔環(huán)境(模擬海拔5 500 m、持續(xù)60 d)非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下的大鼠，肝臟和骨骼肌中脂肪酸的氧化水平增加[19]。研究認(rèn)為，慢性高原暴露(4 300 m,8周)可能通過激活A(yù)MPK使CPT1表達(dá)增加，從而糾正非酒精性脂肪肝的脂質(zhì)堆積[9]。此外，惡性腫瘤的一個(gè)共同特征是持續(xù)的脂肪酸從頭合成，因?yàn)樾枰獫M足腫瘤生長(zhǎng)的生物合成需求，而這個(gè)過程是由限速酶ACC控制的[20]，因此ACC抑制劑有望用于腫瘤治療。以上研究提示，只要缺氧存在，為了產(chǎn)生更多的ATP，脂肪酸氧化就會(huì)合理增強(qiáng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)肝臟組織內(nèi)CPT1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與HIF-1α一致。一項(xiàng)腎透明細(xì)胞癌相關(guān)研究指出，CPT1A是HIF-1和HIF-2復(fù)合物的直接靶基因，并且在腫瘤細(xì)胞中以VHL依賴的方式被抑制，導(dǎo)致脂肪酸分解代謝降低[14]，但在單純的低氧暴露下兩者的關(guān)系有待深入研究。

綜上，本研究顯示，中海拔地區(qū)與平原地區(qū)暴露的大鼠脂肪酸代謝存在差異，中海拔地區(qū)急性暴露期的脂肪酸合成與氧化代謝均可能由于短暫性氧濃度下降而呈現(xiàn)一過性增強(qiáng)，之后隨著缺氧迅速改善，又恢復(fù)到非暴露時(shí)的水平。不同氧濃度下的脂肪酸代謝變化規(guī)律及機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，以后研究應(yīng)深入分析其機(jī)制，進(jìn)一步了解高原地區(qū)暴露后的生理變化，以便采取相應(yīng)的措施來避免、克服高原低氧對(duì)人體的不利影響。