積雪草苷對(duì)小鼠糖尿病心肌病的干預(yù)作用及機(jī)制探討

楊勇，魏東明，喬銳，劉洋，楊劍

1渭南市中心醫(yī)院胸心外科，陜西渭南714099；2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科

糖尿病心肌病(DCM)是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，可引起心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死，是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1-2]。DCM是一種慢性心肌功能障礙，微血管病變是造成DCM病理改變的主要原因，可通過(guò)心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制造成心臟結(jié)構(gòu)和功能損害，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[3-4]。Notch通路是一種進(jìn)化保守的信號(hào)通路，在多種組織中參與維持細(xì)胞多能性，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞再生中起關(guān)鍵作用[5-7]。多項(xiàng)研究表明，Notch信號(hào)通路是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病的關(guān)鍵分子，其介導(dǎo)的相關(guān)凋亡和自噬與DCM心肌損傷關(guān)系密切[8-10]。目前DCM的治療缺乏針對(duì)性藥物，多以對(duì)癥為主，缺乏有效的治療靶點(diǎn)。中藥提取物積雪草苷(ASI)具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、抑制心肌纖維化作用，可通過(guò)不同機(jī)制修復(fù)心肌損傷。2021年1月—8月，本研究觀察了ASI對(duì)DCM小鼠心肌損傷的干預(yù)作用，并從細(xì)胞凋亡和Notch1/Hes1信號(hào)通路方面探討相應(yīng)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 8周齡健康雄性C57/BL小鼠60只，體質(zhì)量(22.07±1.03)g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK(陜)2019-001。Bcl-2、Bax、Caspase-3、Notch1、Hes1、β-actin抗體及ASI購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于天津泰澤興業(yè)生物科技有限公司。肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D Systems公司。FV2000激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于日本奧林巴斯公司。Vevo2100小動(dòng)物超聲儀購(gòu)于美國(guó)VisualSonics公司。

1.2 動(dòng)物分組、給藥方法及模型誘導(dǎo) 60只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分4個(gè)組，每組15只，即對(duì)照組(Sham組)、DCM組、ASI干預(yù)組(ASI+DCM組)和ASI與Notch1抑制劑DAPT聯(lián)合干預(yù)組(ASI+DAPT+DCM組)。Sham組以普通飼料喂養(yǎng)，其余組高脂飼料喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。喂養(yǎng)1個(gè)月后，DCM組、ASI+DCM組、ASI+DAPT+DCM組禁食12 h，腹腔注射STZ 72 h，測(cè)尾靜脈空腹血糖>16.7 mmol/L為造模成功。ASI+DCM組腹腔注射ASI 10 mg/(kg·d)，ASI+DAPT+DCM組腹腔注射ASI 10 mg/(kg·d)和DAPT 10 mg/(kg·d)，DCM組給予相同體積生理鹽水，共給藥5個(gè)月進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 心功能評(píng)價(jià) 每組取15只小鼠，各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后，固定小鼠，將小鼠四肢固定于Vevo2100超聲儀電極上，溫度設(shè)定為37 ℃。用探頭在乳頭肌水平位置用M型取樣線(xiàn)檢測(cè)，通過(guò)軟件測(cè)量并計(jì)算得出左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)等指標(biāo)。

1.4 心肌損傷及纖維化觀察

1.4.1 血清CK-MB、CTGF檢測(cè) 每組取6只小鼠，各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后，固定小鼠，剪開(kāi)并剝離小鼠頸部皮膚、皮下組織，暴露小鼠頸動(dòng)脈，以組織剪剪開(kāi)快速取血2 mL至EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上層血清。按照CK-MB、CTGF檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清CK-MB、CTGF。

1.4.2 心肌結(jié)構(gòu)及纖維化程度觀察 每組取5只小鼠，各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后迅速剪下心臟，冷PBS緩沖液沖洗3遍，洗凈殘余血細(xì)胞后，以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h，石蠟包埋、切片，行HE、Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝。

1.5 心肌細(xì)胞凋亡觀察 每組取5只小鼠，各組小鼠心肌組織石蠟切片按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)染色后，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖像，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行盲法觀察。DAPI染色的每1個(gè)陽(yáng)性點(diǎn)均作為1個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，與之重疊的綠點(diǎn)為凋亡細(xì)胞，用盲測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)除總細(xì)胞數(shù)反映心肌細(xì)胞凋亡程度。采用RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中的Bax、Caspase-3 mRNA。用TRIzol試劑從心肌組織中分離總RNA，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)生成cDNA。用BIO-RAD分光光度法測(cè)定RNA和cDNA的濃度和純度。采用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)并由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成引物。Bax mRNA上游引物序列為5′-AGGGTTTCATTCCAGGATCGAGC-3′，下游引物序列為5′-AGGCGGTGAGGACTCCAGCC-3′；Caspase-3 mRNA上游引物序列為5′-CCTGAAATGGGCTTGTGT-3′，下游引物序列為5′-TGTCTCAATACCGCAGTC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為5′-TGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。采用Western blotting法檢測(cè)心肌組織中的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白。各組小鼠心肌組織取相同質(zhì)量放入離心管中，加入預(yù)冷PBS，剪碎心肌組織，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA強(qiáng)裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA法蛋白定量，電泳并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，裁剪目的條帶，放入對(duì)應(yīng)一抗(Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Caspase-3 1∶1 000)和β-actin抗體(1∶5 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗脫5次，5分鐘/次，將目的條帶放入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶5 000)中室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗脫5次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光液避光檢測(cè)，Image Lab軟件分析灰度值。

1.6 心肌組織中Notch1/Hes1信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 每組取6只小鼠，采用Western blotting法檢測(cè)心肌組織中的Notch1、Hes1蛋白，方法參考“1.5”。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較 DCM組LVEF、FS、LVEDV低于Sham組，LVAWd高于Sham組(P均<0.05)；ASI+DCM組LVEF、FS、LVEDV高于DCM組，LVAWd低于DCM組(P均<0.05)；ASI+DAPT+DCM組LVEF低于ASI+DCM組，LVEDV高于ASI+DCM組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 各組小鼠心肌損傷及纖維化情況比較 DCM組血清CK-MB、CTGF水平高于Sham組，ASI+DCM組血清CK-MB、CTGF水平低于DCM組和ASI+DAPT+DCM組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。Sham組小鼠心肌組織纖維排列整齊、無(wú)斷裂，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)或少有纖維化；DCM組可見(jiàn)細(xì)胞核多逸出，心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，肌纖維斷裂明顯；與DCM組相比，ASI+DCM組肌纖維排列整齊，纖維化程度改善；與ASI+DCM組相比，ASI+DAPT+DCM組心肌纖維化程度明顯增加，排列紊亂。見(jiàn)圖1。

表2 各組小鼠血清CK-MB、CTGF比較

圖1 各組小鼠心肌結(jié)構(gòu)及組織纖維化情況

2.3 各組小鼠心肌組織凋亡相關(guān)指標(biāo)比較 Sham組、DCM組、ASI+DCM組、ASI+DAPT+DCM組凋亡率分別為3.0%±1.2%、21.8%±3.0%、11.0%±1.6%、20.6%±2.7%，DCM組、ASI+DCM組、ASI+DAPT+DCM組細(xì)胞凋亡率高于Sham組，ASI+DCM組細(xì)胞凋亡率低于DCM組、ASI+DAPT+DCM組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。DCM組心肌組織Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)高于Sham組，ASI+DCM組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)低于DCM組、ASI+DAPT+DCM組(P均<0.05)。DCM組心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)低于Sham組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)高于Sham組(P均<0.05)；ASI+DCM組Bcl-2蛋白表達(dá)高于DCM組、ASI+DAPT+DCM組，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)低于DCM組和ASI+DAPT+DCM組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

表3 各組小鼠心肌組織Bax mRNA、Caspase-3 mRNA及Caspase-3、Bcl-2、Bax、Notch1、Hes1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組小鼠心肌組織中Notch1/Hes1信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 DCM組心肌組織中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)低于Sham組，ASI+DCM組Notch1、Hes1蛋白表達(dá)高于DCM組、ASI+DAPT+DCM組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

糖尿病患者心肌組織功能和結(jié)構(gòu)變化普遍存在。DCM發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚。研究表明，包括心肌細(xì)胞自噬、線(xiàn)粒體功能障礙和凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程參與其發(fā)病和進(jìn)展[9-10]。ASI是一種中藥提取物，具有包括抗氧化和抗纖維化在內(nèi)的心臟保護(hù)作用。DCM是糖尿病微循環(huán)系統(tǒng)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)格控制糖尿病患者血糖及抗凋亡有助于減少、減輕糖尿病心臟并發(fā)癥[11-12]。Notch信號(hào)通路與血管發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和炎癥反應(yīng)有關(guān)[11,13-14]。Notch受體(Notch1-4)是一種跨膜蛋白，在細(xì)胞表面表現(xiàn)為異二聚體。Notch通路是一種進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的自我更新、組織的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。Notch1信號(hào)通路的下游基因包括Hes1和HRT，通路激活可減少心肌細(xì)胞凋亡。Notch1/Hes1信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)細(xì)胞增殖、修復(fù)中具有重要作用[16-17]，但其在DCM誘發(fā)心肌損傷中對(duì)凋亡的調(diào)控作用仍未明確。

本研究制作了DCM小鼠模型，給予ASI干預(yù)，結(jié)果顯示，ASI+DCM組心功能指標(biāo)優(yōu)于DCM組和ASI+DAPT+DCM組，心肌損傷指標(biāo)CK-MB、纖維化指標(biāo)CTGF低于DCM組和ASI+DAPT+DCM組，提示ASI可顯著改善心肌收縮和舒張功能，減輕心肌損傷和心肌纖維化。進(jìn)一步觀察凋亡情況發(fā)現(xiàn)，ASI+DCM組細(xì)胞凋亡率低于DCM組、ASI+DAPT+DCM組；ASI+DCM組Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)低于DCM組、ASI+DAPT+DCM組，Bcl-2蛋白表達(dá)高于DCM組、ASI+DAPT+DCM組。這表明ASI的心肌保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Notch1和Hes1已被證明能通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活以保護(hù)心臟的結(jié)構(gòu)和功能[18-19]。Notch通路在心臟缺血期間起著關(guān)鍵作用，激活Notch1/Hes1信號(hào)可減輕缺血再灌注損傷，而這些保護(hù)作用也隨著Hes1的抑制而消失[13]。正常生理?xiàng)l件下，成年大鼠心臟中缺乏Notch信號(hào)因子，在心肌梗死邊緣區(qū)或壓力負(fù)荷心臟中Notch信號(hào)被激活，心臟組織中特異性下調(diào)Notch1可導(dǎo)致心肌肥大、收縮功能抑制、心肌梗死和心肌細(xì)胞凋亡[14]。由于Notch1直接靶向Hes1，ASI可能通過(guò)激活Hes1在DCM模型中發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，在DCM小鼠模型中，Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均下調(diào)，而ASI干預(yù)后Notch1和Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，高于DAPT聯(lián)合干預(yù)組，提示ASI的作用可能與調(diào)節(jié)Notch1/Hes1信號(hào)通路有關(guān)。DAPT是一種有效的特異性抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于特異性阻斷Notch1通路功能[3,20]。因此，抑制Notch1/Hes1通路可能部分消除ASI對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。DAPT還可以部分消除ASI通過(guò)Notch1/Hes1通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。這進(jìn)一步佐證了ASI與Notch1/Hes1信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，ASI可減輕糖尿病心肌病小鼠心肌損傷，減輕心肌纖維化，作用機(jī)制可能與抑制Notch1/Hes1信號(hào)通路、減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步闡明了DCM的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)防和治療DCM藥物的研究提供了參考。