衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠脛骨組織差異表達(dá)miRNA篩選及生物信息學(xué)分析

黃高翔，韋燦燊，蘇曉雪，黎婧，郭蓁，黎靜

1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室；3廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心長(zhǎng)壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

骨質(zhì)疏松癥是以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病[1]。骨吸收、骨形成在空間和時(shí)間上是偶聯(lián)的，如果骨吸收過(guò)度而骨形成不足，就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。衰老性骨質(zhì)疏松癥是年齡增長(zhǎng)引起的以骨吸收大于骨生成為特征的進(jìn)行性代謝性疾病。miRNA參與調(diào)節(jié)骨骼的形成、重塑、代謝等各個(gè)過(guò)程，與骨質(zhì)丟失等骨骼相關(guān)疾病密切相關(guān)[2-3]。但是，以往研究主要集中在絕經(jīng)后骨質(zhì)丟失和骨質(zhì)疏松癥的miRNA表達(dá)譜[4-5]，針對(duì)衰老性骨質(zhì)疏松癥miRNA表達(dá)譜的研究較少，對(duì)于衰老性骨質(zhì)疏松癥的基因譜及生物信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，明確衰老性骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制成為亟待解決的問(wèn)題。2018年6月—2021年6月，本研究篩選了衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠脛骨組織中差異表達(dá)的miRNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步探討miRNA在衰老骨組織進(jìn)展中的分子機(jī)制，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 3月齡雄性BALB/c小鼠40只由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量24～28 g。D-半乳糖、PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。RNasey mini試劑盒購(gòu)自德國(guó)恰根公司。

1.2 小鼠模型制備 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和衰老組，每組20只。衰老組小鼠每天皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg)，對(duì)照組小鼠每天皮下注射等量PBS。3個(gè)月后戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，取兩側(cè)脛骨組織進(jìn)行HE染色觀(guān)察和顯微CT分析。與對(duì)照組相比，衰老組脛骨骨小梁較細(xì)、較稀疏，連接較少；衰老脛骨的骨密度(BMD)、骨小梁相對(duì)容積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)水平顯著降低，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著升高(P均<0.05)，說(shuō)明衰老組衰老性骨質(zhì)疏松癥小鼠模型建立成功。見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠脛骨骨組織微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

1.3 RNA提取 從兩組小鼠脛骨中提取出總RNA，采用RNasey mini試劑盒純化RNA，檢測(cè)RNA濃度后，采用凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。

1.4 脛骨組織差異表達(dá)miRNA分析 小鼠脛骨組織miRNA表達(dá)譜分析委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿桑褂胢iRCURY LNA Array系統(tǒng)對(duì)骨樣本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析。RNA樣本標(biāo)記和雜交后，用Axon Gene Pix4000B微陣列掃描儀獲得原始數(shù)據(jù)，差異表達(dá)miRNA的篩選條件為|logFC|>1.5、P<0.05。

1.5 脛骨組織差異表達(dá)miRNA的靶基因功能分析 采用TargetScan(http://targetscan.org/)和miRDB(http://mirdb.org/miRDB)預(yù)測(cè)脛骨組織差異表達(dá)miRNA的靶基因，利用VEEN圖把2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因取交集。將靶基因?qū)隓AVID6.8(http://david.ncifcrf.gov)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為小鼠，進(jìn)行GO富集分析，研究靶基因的生物功能；進(jìn)行KEGG通路分析，研究靶基因相關(guān)信號(hào)通路。將靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)，限定研究物種為小鼠，并設(shè)置medium confidence>0.4，其他默認(rèn)設(shè)置，獲得靶基因編碼蛋白的相互作用關(guān)系。采用Cytoscape3.7.2軟件的Bisogenet和CytoN-CA插件，篩選富集程度高的相互作用關(guān)系，構(gòu)建miRNA-靶基因—蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 兩組脛骨組織差異表達(dá)miRNA 兩組有20個(gè)差異表達(dá)的miRNA。衰老組較對(duì)照組表達(dá)上調(diào)的miRNA有8個(gè)，分別為miR-5617-5p、miR-10a-3p、miR-3071-5p、miR-16-2-3p、miR-125b-1-3p、miR-344i、miR-181a-1-3p、miR-1934-3p；表達(dá)下調(diào)12個(gè)，分別為miR-211-3p、miR-31-3p、miR-5619-3p、miR-370-5p、miR-450b-3p、miR-96-5p、miR-5136、miR-344d-2-5p、miR-376b-3p、miR-411-5p、miR-15b-5p、miR-499-3p。

2.2 脛骨組織差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè) TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到2 953個(gè)靶基因，miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到4 158個(gè)靶基因。利用VEEN圖取交集，得到1 130個(gè)靶基因。

2.3 脛骨組織差異表達(dá)miRNAs的靶基因GO分析結(jié)果 GO分析結(jié)果顯示，分子功能方面，靶基因主要在酶結(jié)合、蛋白結(jié)合和DNA結(jié)合等方面發(fā)揮作用；細(xì)胞組分方面，多數(shù)靶基因涉及細(xì)胞連接、液泡和突觸等；生物過(guò)程方面，靶基因主要參與蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)調(diào)節(jié)等。見(jiàn)表2。

表2 衰老組脛骨組織中差異表達(dá)miRNA的靶基因GO分析結(jié)果

2.4 脛骨組織差異表達(dá)miRNAs的靶基因KEGG分析結(jié)果 衰老組脛骨組織差異表達(dá)miRNAs的靶基因主要調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等。見(jiàn)表3。

表3 衰老組脛骨組織中差異表達(dá)miRNA的靶基因KEGG通路分析結(jié)果(前10位)

2.5 miRNA-靶基因—蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 兩組差異表達(dá)的miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071與靶基因MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164有緊密聯(lián)系。而且，這些靶基因編碼蛋白具有相互作用關(guān)系。

3 討論

miRNA是由DROSHA酶在細(xì)胞核中把初級(jí)miRNA加工成前體miRNA，再通過(guò)DICER酶在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步加工，上述miRNA與Argonaute蛋白一起組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，其中一條鏈被選擇成為成熟的miRNA。成熟的miRNA通過(guò)與互補(bǔ)的靶基因mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或降解，最終降低靶蛋白表達(dá)。miRNA具有組織特異性、高度保守性和時(shí)序性，對(duì)細(xì)胞和組織的功能起著重要的調(diào)控作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，各種miRNA通過(guò)靶向參與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化過(guò)程的主要轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，最終影響骨的形成和重塑，從而對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞分化起著至關(guān)重要的作用[6-8]。同時(shí)，許多miRNA是不同細(xì)胞和組織衰老過(guò)程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子，并與心血管疾病、腫瘤和阿爾茨海默病等疾病有關(guān)。因此，miRNA在老年性疾病的診斷、治療和預(yù)后方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型有老年性骨質(zhì)疏松癥模型和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，其中構(gòu)建老年性骨質(zhì)疏松癥模型的方法包括自然衰老導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥模型、D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老性骨質(zhì)疏松癥模型等[9]。而D-半乳糖誘導(dǎo)衰老動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用于許多研究[10]。據(jù)報(bào)道，對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行D-半乳糖處理12周后可出現(xiàn)骨質(zhì)流失表現(xiàn)[11]。骨質(zhì)疏松癥早期沒(méi)有明顯臨床特征，而B(niǎo)V/TV、Tb.N、Tb.Th等指標(biāo)可以反映早期骨質(zhì)疏松癥的骨流失，因此骨小梁相關(guān)特征是評(píng)估骨質(zhì)疏松較好的指標(biāo)。顯微CT提供的高分辨影像能分析出更全面的骨骼參數(shù)，因而被廣泛應(yīng)用于觀(guān)察骨小梁結(jié)構(gòu)。本研究采用顯微CT對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老性骨質(zhì)疏松癥模型進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，衰老組小鼠出現(xiàn)了BMD、Tb.N、Tb.Th降低及Tb.Sp升高等骨質(zhì)疏松的相關(guān)表現(xiàn)。在對(duì)骨組織進(jìn)行HE染色分析后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，老年骨中脛骨骨小梁較細(xì)、較稀疏，結(jié)果與顯微CT圖像一致。

在建模成功后，本研究對(duì)對(duì)照組和衰老組骨組織進(jìn)行miRNA芯片檢測(cè)，與對(duì)照組相比，衰老組表達(dá)上調(diào)miRNA有8個(gè)(mmu-miR-5617-5p、mmu-miR-10a-3p、mmu-miR-3071-5p、mmu-miR-16-2-3p、mmu-miR-125b-1-3p、mmu-miR-344i、mmu-miR-181a-1-3p和mmu-miR-1934-3p)，表達(dá)下調(diào)的miRNA有12個(gè)(mmu-miR-211-3p、mmu-miR-31-3p、mmu-miR-5619-3p、mmu-miR-370-5p、mmu-miR-450b-3p、mmu-miR-96-5p、mmu-miR-5136、mmu-miR-344d-2-5p、mmu-miR-376b-3p、mmu-miR-411-5p、mmu-miR-15b-5p和mmu-miR-499-3p)。其中，mmu-miR-96-5p的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較顯著降低。miR-96-5p被認(rèn)為是年齡相關(guān)性骨丟失的潛在診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。miR-96-5p可以通過(guò)直接抑制靶向osterix來(lái)調(diào)節(jié)成骨[12]，并且還可以通過(guò)靶向FOXO1來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞衰老[13]。在表達(dá)上調(diào)的miRNA中，miR-16-2-3p被證實(shí)在骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中表達(dá)增加，并可以通過(guò)直接靶向Wnt5A來(lái)阻斷Wnt信號(hào)通路，抑制骨形成[14]。此外，miR-181a通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中FasL蛋白表達(dá)，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[15]。在表達(dá)下調(diào)的miRNA中，miR-370不僅可以調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞分化，還可直接靶向FOXM1，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，miR-15b不僅可以通過(guò)直接靶向Smurf1作為成骨細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)因子，還可以調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和凋亡。然而，其他差異表達(dá)miRNA在相關(guān)過(guò)程中的作用仍需進(jìn)一步研究。

GO分析結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要參與酶結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞連接、蛋白質(zhì)定位、大分子定位和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程，提示這些miRNA可能在骨老化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，KEGG通路分析結(jié)果表明，MAPK、FoxO、Ras等信號(hào)通路可受到這些靶基因的影響。例如，p38 MAPK通路對(duì)于體內(nèi)正常骨骼形成是必不可少的。缺失任何MAPK途徑成員編碼基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠，均出現(xiàn)骨質(zhì)量和成骨細(xì)胞分化顯著降低。p38α MAPK以衰老依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖、分化及骨重塑。還有研究表明，6個(gè)月大的p38αf/f突變小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥，與破骨細(xì)胞生成和骨吸收增加有關(guān)[16]。此外，F(xiàn)oxO途徑在年齡相關(guān)骨骼退化中具有重要作用。隨著年齡的增長(zhǎng)，F(xiàn)oxO表達(dá)減少可能是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵致病因素[17]。更重要的是，骨組織中活性氧水平隨著年齡和性類(lèi)固醇缺乏而增加，而FoxO蛋白通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶和減少H2O2積累來(lái)限制破骨細(xì)胞形成和骨吸收[17]。此外，Ras信號(hào)通路也可調(diào)節(jié)骨祖細(xì)胞增殖和骨形成。過(guò)度活躍的Ras/MAPK信號(hào)是神經(jīng)纖維蛋白缺乏小鼠脛骨骨不連骨折的關(guān)鍵因素。因此，Ras/MAPK通路失調(diào)很可能也是骨礦化減少的重要原因。

此外，本研究通過(guò)miRNA及其靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系找到了節(jié)點(diǎn)miRNA和靶基因，提示miRNA-96-5p、miRNA-5617、miRNA-15b和miRNA-3071可同時(shí)調(diào)控MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1和CD164等多個(gè)靶基因，更重要的是這些靶基因的編碼蛋白存在相互作用。這提示差異表達(dá)miRNA可能在調(diào)控骨老化過(guò)程中起重要作用。其中，MAP2K1是調(diào)控細(xì)胞周期和衰老的重要基因之一。UBE2G1是一種針對(duì)異?；蚨虊勖鞍踪|(zhì)進(jìn)行降解的重要物質(zhì)[18]。VDAC1是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡的多功能線(xiàn)粒體蛋白[19]。P4HB可抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集，其敲除可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。CD164是一種潛在的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，參與細(xì)胞增殖和凋亡。

由此可見(jiàn)，miRNA在衰老性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有重要作用，相關(guān)關(guān)鍵基因有望作為預(yù)防和治療衰老性骨質(zhì)疏松癥的藥物靶點(diǎn)。