米諾環(huán)素抑制5-脂氧合酶對未控制失血性休克大鼠肝組織的保護(hù)作用

鄭強(qiáng) 溫天明 舒其琛 楊虎 翟祥龍 劉世平

1成都市第一人民醫(yī)院急診科（成都 610000）；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科（四川南充 637000）

米諾環(huán)素（Minocycline，MC）是一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物，它除了良好的抗菌作用外，還具有抗炎、抗凋亡、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、清除氧自由基、免疫抑制等其它作用，在多種臟器缺血再灌注損傷中發(fā)揮了組織細(xì)胞保護(hù)作用，減輕了組織缺血再灌注損傷［1］。已有研究表明在失血性休克大鼠模型中用MC 可明顯減輕休克引起的細(xì)胞壞死、凋亡與氧化應(yīng)激等，但具體機(jī)制不完全清楚［1］。有研究發(fā)現(xiàn)MC 可抑制5-脂氧合酶（5-LOX）的表達(dá)及其活性、進(jìn)而抑制LTs、LTB4 等的生成，減輕中性粒細(xì)胞浸潤［2］。而使用抑制5-LOX 抑制劑MK-886 可減少缺血再灌注后內(nèi)臟器官損傷［3］。據(jù)此推測MC 可通過抑制5-LOX 的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮臟器保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及SD 大鼠失血性休克模型的制備動(dòng)物分組：選用250 ～300 g 的SD 大鼠（由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），使用1%戊巴比妥鈉35 mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉，固定，碘伏消毒，外科手術(shù)分離右股動(dòng)、靜脈并置管，股動(dòng)脈連接三通管后接壓力轉(zhuǎn)換器（Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）、計(jì)算機(jī)行持續(xù)血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測和抽血，股靜脈用于輸液。置管成功后分為：假手術(shù)組（空白組）10 只：僅作置管觀察。液體復(fù)蘇組（對照組）10只：復(fù)蘇時(shí)靜脈給予相應(yīng)的生理鹽水。MK-886 組（實(shí)驗(yàn)組1）：復(fù)蘇時(shí)靜脈給予MK-886（使用DSMO溶解后生理鹽水稀釋）1.2 mg/kg。米諾環(huán)素組（實(shí)驗(yàn)組2）10 只：復(fù)蘇時(shí)靜脈給予米諾環(huán)素20 mg/kg。

未控制失血性休克模型的制備［1］分為4 期：（1）未控制創(chuàng)傷性失血性休克模型建立：模擬院前急救人員到達(dá)之前期（0 ～0.5 h），使MAP 控制在30 ～35 mmHg：通過股動(dòng)脈導(dǎo)管抽取血液及斷尾復(fù)制未控制休克大鼠模型。（2）止血前液體復(fù)蘇期：模擬院前急救期（0.5 ～1.5 h）：通過股靜脈通道給予上述藥物后以乳酸林格氏液進(jìn)行液體復(fù)蘇，同時(shí)予以斷尾失血，使MAP 控制在50 ～60 mmHg。（3）止血及液體復(fù)蘇期：模擬院內(nèi)救治期（1.5 ～3.5 h［2］）：予以手術(shù)止血、血液回輸及乳酸林格氏液復(fù)蘇，目標(biāo)MAP ≥80 mmHg。（4）標(biāo)本收集（3.5 ～24 h）：拔出動(dòng)靜脈置管，放回鼠籠，自由飲食，24 h 后采集血液標(biāo)本后處死采集肝臟組織。

1.2 標(biāo)本處理與指標(biāo)檢測

1.2.1 數(shù)據(jù)與標(biāo)本收集（1）死亡率；（2）0-0.5 h失血量；斷尾失血量（5 mL 燒杯測量）；（3）平均動(dòng)脈壓（MAP）、心率（HR）：0、0.5、1.5、2.5、3.5 h（Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）采集；（4）0.5 ～1.5 h 輸液量（微量輸液泵輸入）；（5）Elisa 法檢測血3.5 h TNF-α、IL-6、肝組織LTs、LTB4 和5-LOX；（6）肝組織一部分用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后備病理組織學(xué)檢查，另一部分制成勻漿，用比色法檢測丙二醛（MDA）、TBA 法檢測髓過氧化物酶（MPO）分析；（7）全自動(dòng)生化分析儀（日立7600 型）檢測血3.5 h 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

1.2.2 TNF-α、IL-6、ALT、AST 的檢測標(biāo)本檢測均為抽取SD 大鼠1 mL 全血后分離血清獲得。取一部分定量肝組織碾磨并生理鹽水定量稀釋后測定MDA、MPO、LTs、LTB4 和5-LOX。取小塊肝組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，逐級(jí)乙醇脫水、二甲苯浸泡、浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼、HE 染色后由我院病理科2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生采用雙盲法對每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行分析。注：米諾環(huán)素、MK-886、IL-6、MPO、LTs、LTB4 和5-LOX 試劑盒購自武漢六合生物技術(shù)有限公司；MDA 試劑盒購自南京建成科技有限公司；ALT、AST 試劑盒購自四川邁克科技有限公司。以上標(biāo)本的檢測均按照操作說明書進(jìn)行并嚴(yán)格遵守各實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

1.3 肝缺血再灌注損傷的Suzuki′s 病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 IRI 的Suzuki′s 病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Suzuki′s pathological scoring criteria for IRI

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間差異比較用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料的數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 25.0軟件包進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 基本資料在未控制失血性休克SD大鼠模型的基本資料如MAP 及HR 由Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)采集，見圖1?？瞻捉M、對照組、實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 死亡率分別為0、50%、30%與20%，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.5～1.5 h 補(bǔ)液量分別為0、（8.7 ± 2.9）、（7.5 ± 3.0）與（6.1 ± 1.9）mL，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組的基本實(shí)驗(yàn)資料Tab.2 Basic experimental data of each group±s

表2 各組的基本實(shí)驗(yàn)資料Tab.2 Basic experimental data of each group±s

注：對照組分別與實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)2 比較，*P ＜0.05；實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 比較，**P ＜0.05

h 失血量（mL）斷尾失血量（mL）0.5～1.5 h 補(bǔ)液量（mL） 時(shí)間（h）MAP（mmHg）HR（次/min）0130.5±15.3345±52 0.5130.5±15.3345±52 0 0 0 1.5130.5±15.3345±52組別空白組對照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2死亡率（%）0 50*30**20 0～0.5 9.5±2.3 9.2±3.0 9.8±2.7 3.2±1.6 2.9±1.8 3.0±1.5 8.7±2.9*7.5±3.0**6.1±1.9 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 130.5±15.3 130.5±15.3 128.5±18.4 32.3±3.2 56.3±5.2 122.4±19.5 119.0±15.8 133.8±18.2 33.5±2.8 54.5±5.9 120.2±20.4 121.2±19.9 131.8±19.6 33.0±2.4 55.5±5.6 125.2±17.4 121.0±16.9 345±52 345±52 340±55 486±69 457±48 375±39 358±49 360±55 480±62 469±50 390±36 380±50 349±59 490±62 449±40 380±46 350±50

圖1 實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 及對照組未控制失血性休克模型血壓和心率電腦采集圖（Pclab-530C 生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集系統(tǒng)）Fig.1 Computer images of blood pressure and heart rate of uncontrolled hemorrhagic shock models in experimental group 1，experimental group 2 and control group（PCLAB-530C biomedical signal acquisition system）

2.2 各組的TNF-α、IL-6 及肝功的變化實(shí)驗(yàn)組2 TNF-α、IL-6 含量明顯低于實(shí)驗(yàn)組1 與對照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組1與對照組比較（P＞0.05）；而實(shí)驗(yàn)組1 肝功能（ALT、AST）與實(shí)驗(yàn)組2 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組1 與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-6、ALT、AST 值Tab.3 TNF-α，IL-6，ALT and AST values in each group x±s

2.3 各組肝臟組織LTs、LTB4和5-LOX的變化實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 肝臟組織LTs、LTB4、5-LOX 值明顯低于對照組（P＜0.05）；且實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組肝LTs、LTB4 和5-LOX 的變化Fig.2 Changes of liver LTS,LTB4 and 5-LOX in each group

2.4 各組肝組織MDA 及MPO 的變化空白組肝組織MDA 及MPO 值均低于對照組、實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2（P＜0.05）；對照組肝組織MDA 及MPO 值均高于實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2（P＜0.05）。見表4。

表4 各組肝組織MDA 及MPO 值Tab.4 MDA and MPO values in liver tissue of each group x±s

2.5 各組肝組織病理切片對照組較實(shí)驗(yàn)組2 和實(shí)驗(yàn)組1 肝細(xì)胞渾濁腫脹明顯，肝細(xì)胞大片狀變性壞死，大部分肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤明顯。見圖3。

圖3 各組肝組織病理切片（HE，×200）Fig.3 The pathological sections of liver tissue in each group were stained by（HE，×200）

2.6 各組肝組織的Suzuki′s 病理學(xué)評(píng)分對照組肝組織的Suzuki′s 評(píng)分值（5.60±1.58）高于實(shí)驗(yàn)組1（3.35 ± 0.89）和實(shí)驗(yàn)組2（3.29 ± 0.92），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 肝組織的Suzuki′s 評(píng)分值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克的處理主要在于早期的液體復(fù)蘇，恢復(fù)機(jī)體有效血容量，滿足組織的灌注，阻止器官組織缺血壞死［4-7］。然而，在液體復(fù)蘇時(shí)，往往引起組織再灌注損傷。組織產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基可作為信息分子，廣泛激活炎癥系統(tǒng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合癥（systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS），引起循環(huán)衰竭和器官損傷，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）甚至多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF）發(fā)生［8-11］。因此早期復(fù)蘇的效果及炎癥反應(yīng)的控制直接決定了創(chuàng)傷后多器官功能不全綜合征、多器官功能衰竭的發(fā)生率。如何防治器官缺血再灌注損傷是救治失血性休克、治療并預(yù)防MODS、提高患者生存率的重要臨床問題。米諾環(huán)素是一種半合成的第二代四環(huán)素衍生物，它除了良好的抗菌作用外，還具有抗炎、抗凋亡、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、清除氧自由基、免疫抑制等作用。研究表明［12-14］，米諾環(huán)素在多種臟器如腦、心、肺、肝等缺血再灌注損傷中發(fā)揮了組織細(xì)胞保護(hù)作用，減輕了組織缺血再灌注損傷。然而其機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

TNF-α、IL-6 能夠誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子，并最終導(dǎo)致廣泛的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷細(xì)胞及組織器官［15］。ALT 及AST 主要反映肝功能指標(biāo)，當(dāng)肝功能受損時(shí)ALT 及AST 則與損傷程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在TNF-α、IL-6、ALT、AST 值的比較中，對照組與實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明米諾環(huán)素與和5-LOX 抑制劑MK-886 均可抑制TNF-α 及IL-6，保護(hù)肝腎等多個(gè)器官。實(shí)驗(yàn)組2 TNF-α、IL-6值低于實(shí)驗(yàn)組1，但實(shí)驗(yàn)組1 肝功能（ALT、AST）與實(shí)驗(yàn)組2 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明米諾環(huán)素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟具有等同的保護(hù)作用，但米諾環(huán)素對除肝臟外的器官保護(hù)作用要優(yōu)于MK-886。

5-LOX 不僅參與腫瘤及癌癥的發(fā)生發(fā)展，還與炎癥反應(yīng)中的促炎因子的釋放密切相關(guān)［16］。MDA與MPO 不但與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，還參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的許多過程，在炎癥反應(yīng)中大量的MDA 與MPO 聚集在炎癥部位而發(fā)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而形成大量的超氧化物和氧化物，最終造成炎癥部位組織細(xì)胞損傷［17］。本研究結(jié)果顯示，對照組與實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 分別比較MDA及MPO 值有明顯差異，說明米諾環(huán)素與MK-886 均可抑制MDA 及MPO，保護(hù)肝腎等多個(gè)器官。但實(shí)驗(yàn)組1 除肝臟組織MDA 及MPO 值與實(shí)驗(yàn)組2 肝臟組織MDA 及MPO 值相近。但對照組與實(shí)驗(yàn)組1肝組織5-LOX、LTs 和LTB4 值及實(shí)驗(yàn)組2 分別比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組1 與實(shí)驗(yàn)組2 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明米諾環(huán)素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟均具有保護(hù)作用。肝組織的Suzuki′s 評(píng)分值也印證了上訴說法，說明米諾環(huán)素可能與MK-886 一樣，通過抑制5-LOX 發(fā)揮抗炎作用，從而發(fā)揮組織保護(hù)作用。

肝組織病理切片顯示對照組較實(shí)驗(yàn)組2 和實(shí)驗(yàn)組1 肝細(xì)胞渾濁腫脹明顯，肝細(xì)胞大片狀變性壞死，大部分肝小葉組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤明顯。以上病理進(jìn)一步說明了米諾環(huán)素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟具有保護(hù)作用。本研究顯示米諾環(huán)素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟保護(hù)的同時(shí)明顯降低了病死率。

綜上所述，在未控制失血性休克模型中MC 與5-LOX 抑制劑MK-886 一樣可通過抑制5-LOX 進(jìn)而抑制LTs、LTB4、TNF-α、IL-6、MAD 和MPO 等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，減輕缺血再灌注后器官組織和細(xì)胞的損傷，進(jìn)而降低死亡率。為院前及院內(nèi)急救使用米諾環(huán)素救治創(chuàng)傷性失血性休克所致的多器官衰竭的早期預(yù)防和治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。