miR-106a-5p靶向STAT3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制

周輝 李睿春 顏大鈞 蔡東鵬 吳文佼 鐘德泉 姜曉丹

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，國家臨床重點?？?，腦血管病診斷與治療教育部工程研究中心，廣東省普通高校腦功能修復(fù)與再生重點實驗室，廣東神經(jīng)外科研究所（廣州 510282）；2 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州 510080）

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，約占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的50%左右，具有發(fā)病率、病死率高等特點［1］。治療以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但往往由于膠質(zhì)瘤邊界不清，呈侵襲性生長，手術(shù)難以完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差。因此，關(guān)于膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)機(jī)制的研究成為近年來關(guān)注的熱點［2］。微小核糖核酸（miRNA）參與細(xì)胞分化、增殖、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程［3-5］。據(jù)報道［6-7］，miR-106a-5p能抑制乳腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并且可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的獨立預(yù)后預(yù)測指標(biāo)［8］，但其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響尚不清楚，本實驗擬研究miR-106a-5p 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲中的作用機(jī)制，為防治膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)提供一種新的靶點。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本材料

1.1.1 樣本來源收集廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2017年1月至2020年12月間接受再次手術(shù)治療的15 例復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者的腫瘤標(biāo)本，其中5 例取自癌旁組織（距腫瘤增強(qiáng)灶邊緣＞1.5 cm）。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者第一次手術(shù)病理報告為膠質(zhì)瘤（WHO 分級Ⅰ～Ⅳ級均可）；年齡＞18 歲，自愿接受再次手術(shù)；無明顯手術(shù)禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎等器官功能障礙；凝血功能異常。本項目得到我院醫(yī)院倫理委員會審核（醫(yī)倫審［2017］第（76）號），參與研究的所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 病例資料患者年齡37 ～64 歲，平均（50.12 ± 7.58）歲；男9 例，女6 例。臨床癥狀：頭痛、惡心嘔吐10 例，偏癱或失語4 例，癲癇1 例。病變位置：額葉7 例，顳葉3 例，頂葉3 例，枕葉2 例；腫瘤直徑＜5 cm 10 例、≥5 cm 5 例；第一次手術(shù)后病理類型：Ⅰ～Ⅱ級2 例，Ⅲ～Ⅳ級13 例；第一次術(shù)后患者KPS 評分60 ～90 分。復(fù)發(fā)時間4 ～26個月，平均（15.87±6.93）個月。5 例癌旁組織取自額葉腫瘤旁。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株GL261（賽百慷，上海），正常培養(yǎng)體系：95%DMEM+ 5%胎牛血清（Gibco，美國）+ NGF 20 ng/mL（Affinity，美國）+谷氨酰胺100 μg/mL。

1.3 主要試劑與儀器熒光染料SYBR Green I（Invitrogen，美國），引物序列設(shè)計、慢病毒包裝及表達(dá)載體構(gòu)建（銳博生物，廣州），Trizol 試劑盒（Sigma，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme Biotech，美國），LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen，美國），一抗STAT3 蛋白（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3）、BAX 蛋白（Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白）、cl-caspase-3蛋白（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3）以及p21 蛋白（Affinity，美國）。Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)皿（Gibco，美國），紫外可見分光光譜儀（Thermo，美國），定量PCR 儀（StepOnePlus?，美國）。

1.4 方法

1.4.1 qPCR 檢測細(xì)胞中miR-106a-5p 和STAT3水平提取細(xì)胞總RNA（Trizol 法）并測定純度和濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄。SYBR Green 染料法進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)條件：95 ℃下使模板DNA變性30 s →55 ℃下退火30 s →72 ℃延伸60 s，循環(huán)30 次。最后在72 ℃下擴(kuò)展10 min，收集熒光信號。各樣品重復(fù)3 次。內(nèi)參為GAPDH，使用2-ΔΔCT法計算miR-106a-5p 和STAT3 的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組將GL261 細(xì)胞按按105/mL 接種于6 孔板中，分別轉(zhuǎn)染構(gòu)建的miRNA-NC mimics、miR-106a-5p mimics、miR-106a-5p inhibitor質(zhì)粒（銳博生物，廣州）24 h，并對應(yīng)分組，正常的GL261 為Control 組。具體轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000 試劑盒進(jìn)行。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡（WB）檢測各組細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)將各組細(xì)胞置于冰上，裂解1 h 后提取總蛋白（RIPA 法），檢測蛋白濃度（BCA 法），每孔上樣50 μg。配置10%分離膠（SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒），140 V 電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應(yīng)目的條帶，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。滴加相應(yīng)兔抗小鼠STAT3、BAX、cl-caspase-3、p21 一抗（1∶1 000），并在4 ℃孵育過夜。用1×TBST 洗膜3 次，次日滴加山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。洗膜3 次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。選擇GADPH 作為內(nèi)參，用Image J 軟件測定目的蛋白灰度值，按目的蛋白灰度值除以GADPH 灰度值計算其相對表達(dá)量。

1.4.4 TargetScan 預(yù)測和雙熒光素酶報告確定miR-106a-5p和STAT3的關(guān)系借助在線生物信息分析軟件TargetScan7.1（http：//www.targetscan.org/），預(yù)測出STAT3 是miR-106a-5p 的靶基因之一。再利用雙熒光素酶基因報告實驗驗證二者間的靶向關(guān)系；依據(jù)預(yù)測的可能結(jié)合位點，分別構(gòu)建包含該位點（Wt）和突變位點（Mut）的DNA 片段（銳博生物，廣州）；并將其與miR-106a-5p 共轉(zhuǎn)染至GL261 中培養(yǎng)48 h，最后測定熒光素酶的活性。

1.4.5 CCK-8 實驗測定過表達(dá)miR-106a-5p 在GL261 增殖中的作用在96 孔板中按適當(dāng)密度接種轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimics 的GL261，培養(yǎng)基每2天更換一次。并在12、24、48、72 h查看細(xì)胞狀態(tài)，然后各孔添加CCK-8 溶液10 μL 后孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔細(xì)胞的吸光值（A450），繪制增殖率曲線，細(xì)胞增殖率=（A實驗-A空白）/A空白×100%。

1.4.6 Transwell 實驗測定miR-106a-5p mimics 對GL261 侵襲力的作用先在Transwell 培養(yǎng)皿內(nèi)室中鋪上新鮮制備的Matrigel 基質(zhì)膠，37 ℃干燥2 h。再將轉(zhuǎn)染miR-106a-5p mimics 的GL261 細(xì)胞接種于Transwell 的內(nèi)室，在下室中加入DMEM 培養(yǎng)基（含20%胎牛血清）500 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 d 后輕輕擦去內(nèi)室底部Matrigel 膠和未侵襲的GL261 細(xì)胞，多聚甲醛固定30 min，DAPI 室溫下染色30 min，在顯微鏡高倍視野下對細(xì)胞進(jìn)行拍照和計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法對實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0（IBM，美國）進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 方法；若是偏態(tài)分布時，采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)變量采用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106a-5p 在人復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織和GL261細(xì)胞中的水平qPCR 結(jié)果顯示，在人復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中，miR-106a-5p 水平明顯少于周圍癌旁組織（P＜0.01）。在GL261 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的水平也顯著低于正常神經(jīng)細(xì)胞（P＜0.05），見圖1。

圖1 人復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織和GL261 中miR-106a-5p 的水平Fig.1 The levels of miR-106a-5p in human recurrent glioma and GL261

2.2 轉(zhuǎn)染miR-106a-5p 模擬物的GL261 中STAT3的表達(dá)水平相比Control 組，轉(zhuǎn)染了miR-106a-5p mimics 質(zhì)粒的GL261，miR-106a-5p 的水平明顯升高（P＜0.01），同時STAT3 的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；在miR-106a-5p inhibitor組中，miR-106a-5p 水平明顯降低（P＜0.01），STAT3 的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖2 miR-106a-5p 的表達(dá)對GL261 中miR-106a-5p 和STAT3 的影響Fig.2 Expression of miR-106a-5p affects the levels of miR-106a-5p and STAT3 in GL261

2.3 雙熒光素酶驗證miR-106a-5p 和STAT3 的靶向關(guān)系TargetScan 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-106a-5p與STAT3 的3′UTR 存在部分結(jié)合位點（圖3A），預(yù)測miR-106a 對STAT3 的表達(dá)具有一定調(diào)控作用。在雙熒光素酶基因報告中，顯示共轉(zhuǎn)染STAT3-WT野生型和miR-106a-5p mimics 的細(xì)胞中熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01，圖3B），驗證了miR-106a-5p 與STAT3 之間存在著互為靶向的關(guān)系。

圖3 預(yù)測和驗證miR-106a-5p 與STAT3 間的相互關(guān)系Fig.3 Predict and verify the relationship between miR-106a-5p and STAT3

2.4 過表達(dá)miR-106a-5p 對GL261 細(xì)胞增殖和侵襲的影響CCK-8 和Transwell 結(jié)果顯示，相比Control 組，miR-106a-5p mimics 組GL261 細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少（P＜0.05，圖4A），細(xì)胞侵襲能力也顯著下降（P＜0.01，圖4B）。

圖4 過表達(dá)的miR-106a-5p、在GL261 增殖與侵襲中的作用（×400）Fig.4 Over-expression of miR-106a-5p affects on proliferation and invasion in GL261（×400）

2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測各組GL261 中相關(guān)凋亡分子的表達(dá)蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與Control 組相比，miR-106a-5p mimics 組STAT3 的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），但BAX、cl-caspase-3 及p21 的表達(dá)顯著上升（P＜0.01）；miR-106a-5p inhibitor 組STAT3 表達(dá)顯著升高（P＜0.01），BAX、cl-caspase-3 及p21 的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-106a-5p 對GL261 中BAX、cl-caspase-3 和p21 水平的作用Fig.5 The levels of Bax,cl-caspase-3 and p21 in GL261 were affected by mir-106a

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一類惡性腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的50%左右，預(yù)后極差，其中高級別膠質(zhì)瘤患者的平均生存期僅有12 ～15 個月［1］。如何延長膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)時間，提高患者生存時間，成為膠質(zhì)瘤研究的核心。目前，手術(shù)的切除程度、術(shù)后放化療或其他新興分子靶向藥物等是研究控制膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的主要方向［9］。以往很多研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可以通過介導(dǎo)調(diào)控靶基因的表達(dá)參與多中癌癥的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)，本團(tuán)隊以往也證實miR-107 參與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長和侵襲［10］，但鮮有報道m(xù)iRNA 的異常表達(dá)在膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用的機(jī)制。有學(xué)者證實，miR-106a-5p是多種腫瘤潛在的抑癌基因，并且可以作為一個獨立的標(biāo)記物對膠質(zhì)瘤患者治療效果和預(yù)后進(jìn)行評價［6-9］。然而其在膠質(zhì)瘤，尤其在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤中的生物特性及作用機(jī)制尚未明確。本研究中首次收集15 例復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤患者再次手術(shù)切除的腫瘤組織與5 例癌旁組織樣本，通過qPCR 檢測miR-106a-5p 的水平，發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p 在復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，與文獻(xiàn)報道［10］的在原發(fā)膠質(zhì)瘤中低表達(dá)一致，表明miR-106a-5p 也可以作為抑制復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤生長的一個潛在靶點。

STAT3 是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的信號轉(zhuǎn)錄因子家族之一，被認(rèn)為是促癌基因，參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲與凋亡［11］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)STAT3在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過抑制STAT3 的激活來抑制腎癌細(xì)胞增殖與侵襲［12］。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3 也明顯增強(qiáng)，抑制JAK2/STAT3 信號通路也能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。因此在本研究將miR-106a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染至小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株GL261 中，觀察二者之間的表達(dá)量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-106a-5p 負(fù)調(diào)控STAT3 的表達(dá)。接著通過TargetScan 生物在線軟件預(yù)測了STAT3 就是miR-106a-5p 的靶基因，進(jìn)一步雙熒光素酶基因報告證實了它們二者之間的相互作用。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-106a-5p 可下調(diào)STAT3 的水平，同時過表達(dá)miR-106a-5p 可以下調(diào)GL261 細(xì)胞的增殖和侵襲能力，表明STAT3 是miR-106a-5p 的下游靶基因。

以往研究顯示，STAT3 激活可以干擾腫瘤細(xì)胞的凋亡，通過上調(diào)p21、cl-caspase-3 的表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡，同時STAT3 也參與BAX、cl-caspase-3、p21 等蛋白的表達(dá)［14-15］。在LIAO 等［16］的實驗中，阻斷STAT3 在腫瘤組織中的激活，增加了BAX、p21 的水平，下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，降低了腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量。其中BAX、cl-caspase-3 是凋亡相關(guān)因子［17-18］，p21 是周期蛋白依賴激酶抑制基因［19］，在細(xì)胞的凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果也顯示，miR-106a-5p 的過表達(dá)在下調(diào)STAT3 表達(dá)的過程中，也升高了BAX、cl-caspase-3 和p21 的表達(dá)水平，有可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡來抑制膠質(zhì)瘤的生長，有待以后進(jìn)一步的研究。

綜上，miR-106a-5p 低表達(dá)于人復(fù)發(fā)膠質(zhì)組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，過表達(dá)miR-106a-5p 可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中STAT3 的表達(dá)，減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子BAX、clcas-pase-3 及抑癌基因p21 的表達(dá)，為防治膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)提供了一個新的靶點。