海南粗榧研究進展

林玲，黃川騰，陳飛飛，董曉娜

海南省林業(yè)科學(xué)研究院（海南省紅樹林研究院），海南海口571100

海南粗榧（Cephalotaxus manniiHook.f.），為三尖杉科，三尖杉屬喬木植物，已被列入中國植物紅皮書中，并確立為國家I級重點保護植物[1]。目前從海南粗榧中已分離并鑒定出生物堿50種[2]，其主要成分三尖杉酯堿類對治療白血病和急性淋巴病有特殊療效，是目前抗癌最有潛力的自然藥源之一，但是由于樹種自身原因和人為破壞與干擾，該樹種瀕臨滅絕[3]。龐曉慧等[4]綜述了海南粗榧的資源學(xué)研究及相關(guān)的繁殖技術(shù)研究。隨著研究的深入，不少的新研究內(nèi)容和技術(shù)相繼報道，該文擬較全面對國內(nèi)外諸多學(xué)者圍繞海南粗榧核形態(tài)學(xué)、藥用成分、內(nèi)生真菌、遺傳多樣性、群落學(xué)、繁育技術(shù)等現(xiàn)階段的研究進展進行了綜述，并提出未來的研究方向，以期為其深入研究和保護利用提供參考。

1 資源學(xué)研究

海南粗榧在國內(nèi)主要分布于海南、廣東、廣西、云南和西藏，在海南又主要分布于尖峰嶺、霸王嶺、鸚哥嶺、吊羅山等自然保護地中[5]。海南的海南粗榧株數(shù)和蓄積量均約占全國總量的90%，占粗榧資源絕對優(yōu)勢[1]，該樹種是海南傳統(tǒng)的優(yōu)良用材樹種，在商品材采伐時代被列為二類材[6]。

2 種群和群落學(xué)研究

海南粗榧多生于海拔700m～1200m的山地雨林中的山地黃壤，在海南常與紅錐（Castanopsis hystrix），母生（Homalium ceylanicum），雞毛松（Dacrycarpus imbricatusvar.patulus）等混生[3]。對海南霸王嶺的海南粗榧群落植被生物多樣性研究結(jié)果表明，不同樣方中的喬、灌、草各層的生物多樣性指數(shù)出現(xiàn)極顯著差異，但同一樣方中喬木層和灌木草本層生物相差不大，主要優(yōu)勢種為紅紫麻（Oreocnide rubescens）、野芭蕉（Musa balbisiana）、藥用狗牙花（Tabernaemontana bovina）等[7]。

3 結(jié)構(gòu)解剖學(xué)研究

對海南粗榧的葉片結(jié)構(gòu)和莖次韌皮部解剖結(jié)果表明，為雙環(huán)型氣孔，氣孔密度47.3個/mm2～88.1個/mm2，無皮下層，有些葉肉中具星狀石細(xì)胞、短石細(xì)胞、纖維狀石細(xì)胞，有些完全無，下表面具明顯的角質(zhì)突起[8-9]，但杜道林等[10]研究表明，海南粗榧葉表面氣孔為12列～15列（多數(shù)為14列），氣孔結(jié)構(gòu)為完全或不完全的雙環(huán)型氣孔或單環(huán)型氣孔，大小變化較大，副衛(wèi)細(xì)胞2個～6個（多數(shù)為2個），同時表明環(huán)境因子對海南粗榧葉氣孔結(jié)構(gòu)影響差異很大，與土壤質(zhì)地、厚度、營養(yǎng)狀況、坡度、光照等環(huán)境因子關(guān)聯(lián)度很大[11]。

4 分子生物學(xué)

釆用RAPD技術(shù)從分子水平分析，結(jié)果表明海南粗榧除了與篦子三尖杉的親緣關(guān)系較遠，支持將篦子三尖杉獨立成組[12]；喬飛等[13]研究海南粗榧PDS基因和利用NJ法建立系統(tǒng)進化樹，表明海南粗榧PDS是真核的裸子植物，其位置處于單獨一個分支上。

5 遺傳多樣性研究

向志強等[14-15]對吊羅山、卡法嶺、尖峰嶺、霸王嶺、黎母山5個海南粗榧種群開展研究，對海南粗榧種群遺傳多樣性和遺傳分化程度分析結(jié)果表明，種群遺傳多樣性水平較低，種群間遺傳分化程度較低，黎母山種群與其它種群分化最大，可能是受到傳粉時盛行的風(fēng)向影響有關(guān)。調(diào)查結(jié)果表明，5個種群的植株總體形態(tài)都未產(chǎn)生分化，而單一性狀上，僅吊羅山種群體現(xiàn)出群體化的趨勢，但分化不明顯；王峻玉等[16]開展以上5個海南粗榧種群染色體水平遺傳多樣性研究，結(jié)果表明海南粗榧不同種群核型表現(xiàn)出一定差異，但是差異不顯著，種群內(nèi)的變異量總是遠遠超過種群間的變異量，5個海南粗榧種群間在常規(guī)染色體的遺傳變異中，來自于種群間的變異平均只有10%，約90%變異來自于種群內(nèi)的個體和細(xì)胞間，種群間進行著頻繁的基因交換。

6 海南粗榧藥用研究

6.1 有效藥用成分分離提取

20世紀(jì)70年代初至80年代以來，從海南粗榧中分離出17個生物堿和2個內(nèi)酯[17]，至目前，已從海南粗榧中分離鑒定出50余種生物堿，其主要成分為三尖杉酯類生物堿[2]。三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、異三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿、海南粗榧新堿、海南粗榧內(nèi)酯、紅殼松生物堿（簡稱紅堿）有較強的抗腫瘤活性，已開發(fā)成治療多種癌癥的藥物[18-21]；還從海南粗榧乙醇提取物中分離得到3個苯丙素類化合物和2個木脂素類化合物，均具有抗氧化活性[22-23]。

6.2 有效藥用成分合成

6.2.1 懸浮細(xì)胞和生物堿的合成研究

海南粗榧現(xiàn)有資源嚴(yán)重稀缺，海南粗榧懸浮細(xì)胞來促進三尖杉醋類堿的合成，可以有效解決稀有藥用資源的供需矛盾。陳林等[24]使用海南粗榧愈傷組織進行懸浮培養(yǎng)，利用HPLC技術(shù)檢測懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基中生物堿的含量；陳蕾等[25]利用RACE技術(shù)從海南粗榧中克隆出紫杉烷13α-羥化酶基因，合成紫杉醇。龍曉娟等[26]研究表明在海南粗榧懸浮培養(yǎng)第15d分別添加100μmol/L茉莉酸甲酯和50μmol/L水楊酸最有利于三尖杉酯類堿的合成。蔣旋嫻等[27]研究指出L-色氨酸及其衍生物5-MT能抑制代謝支路，促進代謝流向產(chǎn)物三尖杉酯類堿的方向；潘亞華等[28]研究表明海南粗榧細(xì)胞固定化培養(yǎng)，抑制了細(xì)胞的生長，延長了細(xì)胞的生長周期，但縮短了細(xì)胞生產(chǎn)三尖杉酯堿的周期。

6.2.2 海南粗榧新堿研究

海南粗榧新堿的研究比較熱門。20世紀(jì)80年代初，從海南粗榧的樹皮和三尖杉中分離到海南粗榧新堿，通過單晶衍射以及波譜學(xué)，最終確定海南粗榧新堿的結(jié)構(gòu)[29-30]，學(xué)者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)海南粗榧新堿具有邊緣抗腫瘤活性，對白血病有一定療效，但尹大力等[31]卻發(fā)現(xiàn)海南粗榧新堿的溶解性較差，動物體內(nèi)吸收很少。為改善溶解性能及提高活性，發(fā)現(xiàn)并篩選了一些具有較好生物活性的衍生物，并通過人工手段，合成較好的抗腫瘤的藥物[32-35]。

6.2.3 內(nèi)生真菌研究

植物內(nèi)生真菌是指生活在植物體內(nèi)或生活史的一定階段處于植物體內(nèi)的真菌，與宿主形成長期互惠共生關(guān)系[36]，許多內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝物，具有多種活性，包括抗腫瘤活性[37]。陳蘋等[38]從海南粗榧中分離得到72株內(nèi)生真菌，其中68株為半知菌類，其對宿主具有一定的組織專一性；蔡坤等[39]從海南粗榧樹皮樣品中分離得到213株內(nèi)生真菌，它們分屬34個屬，未知屬37株；齊靜等[40]分離獲得416個內(nèi)生真菌菌株，分屬12個屬，其中10屬為半知菌，2屬為子囊菌；吳延春等[41]從海南粗榧中第一次分離獲得生赤殼屬內(nèi)生真菌。可見隨著研究不斷深入，分離鑒定出來的內(nèi)生真菌越來越多。

7 繁育技術(shù)研究

7.1 種子育苗技術(shù)

王有生等[42]和王獻溥[43]研究報道海南粗榧為雌雄異株，10月～11月種子成熟，樹種結(jié)實具有明顯的大小年、結(jié)實量少，且休眠期較長。而種子在低溫儲藏80d～100d催芽后，可提高發(fā)芽率。曾祥全等[44]研究指出，未經(jīng)催芽就播種，240d以后才陸續(xù)發(fā)芽，發(fā)芽不整齊，而且發(fā)芽率較低。在常溫下濕沙催芽90d左右，播種60d后，種子發(fā)芽率約30%；采用濕沙在低溫下層積催芽90d左右，播種60d后，其種子發(fā)芽率可提高到72%。莫世琴等[45]5℃～10℃低溫下用濕沙或濕椰糠層積催芽90d，45d后，種子就開始發(fā)芽，出芽率可達80%。

7.2 扦插育苗技術(shù)

王獻溥等[43]在秋季，以河沙為基質(zhì)，3年生枝條作插穗，未經(jīng)任何處理開展扦插試驗，生根率為26.5%；使用激素ABT1000mg/L處理插穗，生根率可達82.5%。而使用激素IBA1000mg/L～1500mg/L處理插穗的效果也較好，插條生根率可達70.0%以上，平均生根數(shù)為3.8條～4.0條；椰糠基質(zhì)扦插效果均好于河沙、沙混土和表土的基質(zhì)，側(cè)枝扦插較直生枝容易生根[46-47]。研究還發(fā)現(xiàn)秋季或冬季的扦插效果好與其他季節(jié)[48-49]。劉進平等[50]以2000mg/L的萘乙酸（NAA）處理未完全木質(zhì)化的枝條3h的生根效果最好，成活率在90%以上，完全不處理則不能生根成活；黃桂華等[48]研究則以甘蔗渣和表土按1：1混合攪拌為基質(zhì)，以1500mg/L的激素IBA濃度為生根劑處理插穗，生根率最高，可達到84.89%；陳飛飛等[49]選取0.5年生～1年生健壯枝條，剪成長度8cm～10cm的插穗，以2000mg/L的ABT溶液蘸藥3min處理，河沙、椰糠、紅土等比例配制成的混合基質(zhì)，扦插生根效果較好，生根率最高可達80.67%。

7.3 組織育苗技術(shù)

選用海南粗榧的莖尖、芽、莖段、幼苗根段的離體組織進行組培，能誘導(dǎo)出愈傷組織，但未能進行離體繁殖[43，51]。而李志英等[52]采用海南粗榧的莖段進行組織培養(yǎng)，小苗最高成活率達80%左右。外植體滅菌和愈傷組織褐變是影響組織培養(yǎng)成果的兩大因素，針對這兩大難題，劉進平等[53]選用海南粗榧溫室扦插苗的嫩莖段外植體滅菌和愈傷組織誘導(dǎo)開展實驗，篩選出MS+0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/LBA+2.5～4.0mg/L2，4～D培養(yǎng)基，以70%酒精表面消毒處理1min后，以0.1%氯化汞溶液消毒12min，誘導(dǎo)愈傷組織效果最好；王成韜等[54]探討不同滅菌方法對海南粗榧外植體污染和細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明，以75%酒精滅菌1min、臭氧滅菌30min，再用0.1%HgCl2溶液滅菌10min的滅菌方法最佳，其外植體污染率5%，愈傷組織誘導(dǎo)率95%，外植體細(xì)胞活力比對照提高38%。王成韜等[55]研究發(fā)現(xiàn)葉片外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織褐變率較莖段外植體低，抗褐變劑和激素的合理配比能有效地抑制愈傷組織培養(yǎng)中的褐變，促進其生長。

8 研究展望

海南粗榧屬于中國珍稀瀕危植物資源，為國家I級重點保護野生植物，由于其自然生境遭受破壞和盜伐的威脅，導(dǎo)致種群數(shù)量和規(guī)模急劇下降、資源不斷減少等問題。為了更全面地保護海南粗榧樹種，建議應(yīng)從以下3個方面加強研究。

（1）深入開展內(nèi)生真菌研究。由于海南粗榧資源有限，單純的利用海南粗榧來提取有效藥物，難于規(guī)?；a(chǎn)，但是繼抗癌藥用植物細(xì)胞組織培養(yǎng)之后，利用抗癌藥用植物內(nèi)生真菌來生產(chǎn)抗癌藥物成為一個新的熱點，從海南粗榧內(nèi)生真菌已發(fā)現(xiàn)不少的代謝產(chǎn)物并篩選出具有抗腫瘤活性的菌株及活性成分，可見對于有效藥用成分的篩選和開發(fā)，海南粗榧內(nèi)生真菌具有很大的研究空間。

（2）深入開展培育技術(shù)研究。為了能盡快緩解市場對海南粗榧的需求，對海南粗榧種子、扦插及組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)等繁育技術(shù)進行了大量的研究，但至今海南粗榧未能生產(chǎn)大量苗木，還不能為推廣奠定堅實的基礎(chǔ)，而高效的種植技術(shù)也是擴大資源量的有效方法，如何克服因為留有位置效應(yīng)側(cè)枝扦插未能產(chǎn)生直立植物（匍匐植株），如何更有效率用側(cè)枝扦插產(chǎn)生的匍匐植株，則需要更深入開展培育技術(shù)的研究。

（3）做好保育研究工作。海南粗榧為珍稀瀕危保護植物，但至今自然生境下海南粗榧的的光、溫、水、肥、熱等生態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性還有許多方面還未清楚，海南粗榧的許多的致瀕原因還未認(rèn)識到位。因此，需要繼續(xù)做好海南粗榧的保育研究。