甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)m 6A修飾異常m RNA的分析

王 苗，王全凱，李昕葦，馬順鵬，烏瀚寶櫟爾，許建寧，

（1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；2．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心化學(xué)污染與健康安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（glycidyl methacrylate，GMA）是一種聚合反應(yīng)用單體，其反應(yīng)產(chǎn)物可作為牙科和骨科中使用的密封劑和黏合劑，也作為加工過程的副產(chǎn)品或包裝成分存在于食品中。GMA慢性吸入染毒，可觀察到大鼠、小鼠發(fā)生鼻腔鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤等多種類型腫瘤。2019年國(guó)際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）將GMA歸類為“對(duì)人類很可能致癌物”（2A類）?；瘜W(xué)致癌物的致癌過程，涉及基因突變和表觀遺傳改變及其相互作用。研究表明，GMA具有致突變性，可引起人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生基因突變、染色體畸變等；但其致癌機(jī)制中表觀遺傳學(xué)部分有關(guān)RNA修飾的內(nèi)容尚未見研究報(bào)道。

N-甲 基 腺 嘌 呤（N-methyladenosine，mA），即RNA中腺苷酸（A）第6位N原子上發(fā)生的甲基化，是真核生物mRNA中最豐富的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾。mA修飾受到甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶動(dòng)態(tài)可逆的調(diào)控，并且通過與識(shí)別蛋白的結(jié)合影響mRNA的加工和代謝過程，調(diào)控基因表達(dá)。研究表明mA RNA甲基化在腫瘤的形成和發(fā)展中扮演著重要的角色。本研究利用高通量人類表觀轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)合生物信息學(xué)方法，對(duì)GMA誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）的mRNA mA修飾水平和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，篩選出mA修飾的mRNA并進(jìn)行功能解釋，為從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)一步研究GMA的致癌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（純度≥98.5%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；MEM培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）和胎牛血清由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；青鏈霉素混合液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA Flash Labling Kit和RNA標(biāo)記試劑盒由美國(guó)Arraystar公司生產(chǎn)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和DynabeadsM-280綿羊抗兔IgG抗體由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)；親和純化抗mA兔多克隆抗體由德國(guó)Synaptic Systems公司生產(chǎn)；RNase抑制劑由美國(guó)Enzymatics公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒由QIAGEN公司生產(chǎn)。

CO恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Beckman公司；倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；ND-1000分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)NanoDrop公司；Arraystar Human mRNA &lncRNA Epitranscriptomic Arrays芯片技術(shù)服務(wù)和引物設(shè)計(jì)的技術(shù)支持由上?？党缮锕咎峁?/p>

1.2 高通量人類表觀轉(zhuǎn)錄組芯片檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)與GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的方法參照楊敏等的報(bào)道。本課題組既往研究已證實(shí)，以8μg/mL濃度GMA（DMSO為對(duì)照組）重復(fù)染毒16HBE細(xì)胞后，傳代至第30代的細(xì)胞具備惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生物學(xué)特性。采用TRIzol提取并收集細(xì)胞總RNA。使用Nanodrop ND-1000對(duì)每個(gè)樣本的總RNA進(jìn)行定量，使用抗N-甲基腺苷（mA）抗體免疫沉淀，mA修飾的RNA從免疫沉淀磁珠中洗脫，稱為“IP”，未修飾的RNA從上清液中回收作為“Sup”。將“IP”和“Sup”RNA擴(kuò)增為cRNA，并分別使用Arraystar Super RNA標(biāo)記試劑盒進(jìn)行Cy5和Cy3標(biāo)記。將標(biāo)記的cRNA混合，在Agilent雜交箱中于65℃下與芯片雜交17 h。洗滌芯片后，用Agilent Scanner G2505C在雙色通道中掃描獲得陣列圖像。

1.3 m6A修飾水平異常mRNA和表達(dá)水平異常mRNA的篩選

使用Agilent特征提取軟件（v11.0.1.1）對(duì)采集到的陣列圖像進(jìn)行分析。IP（免疫沉淀，Cy5標(biāo)記）和Sup（上清液，Cy3標(biāo)記）的原始信號(hào)值進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針（某探針在6個(gè)樣品中至少有1個(gè)被標(biāo)記為Present或Marginal）進(jìn)行進(jìn)一步分析。mA甲基化水平根據(jù)轉(zhuǎn)錄物中修飾RNA的百分比進(jìn)行計(jì)算；在探針標(biāo)記篩選之前，使用limma軟件包的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化方法對(duì)陣列間RNA表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，RNA表達(dá)水平以轉(zhuǎn)錄本中修飾RNA和未修飾RNA的總量計(jì)算。

以變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的絕對(duì)值≥2且

P

＜0.05作為閾值，篩選兩組樣品間mA修飾水平差異的mRNA和表達(dá)水平差異的mRNA。采用分級(jí)聚類的方法對(duì)兩組樣本間mA修飾水平差異的mRNA進(jìn)行展示，將篩選出的表達(dá)水平差異mRNA以散點(diǎn)圖的形式進(jìn)行可視化。

1.4 mRNA m6A修飾水平與mRNA表達(dá)水平的聯(lián)合分析

經(jīng)上述步驟可得GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的mRNA mA修飾水平和mRNA表達(dá)水平，使用Visual Studio Code軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將這兩個(gè)表達(dá)譜中的mRNA互相取交集，得到mA修飾的mRNA，結(jié)果以四象限圖表示。

1.5 m6A修飾mRNA的GO富集分析和KEGG通路分析

以人類基因組為背景對(duì)照，利用在線分析工具Omicshare（https://www.omicshare.com/tools/）進(jìn)一步對(duì)上述mA修飾mRNA進(jìn)行功能解釋，即GO富集分析和KEGG通路分析。GO分析使用0.05的閾值識(shí)別顯著豐富的GO術(shù)語(yǔ)，通路分析利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，閾值為0.05。

2 結(jié)果

2.1 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中m6A修飾水平異常的mRNA

利用NanoDrop ND1000分光光度計(jì)檢測(cè)GMA組和DMSO組16HBE第30代細(xì)胞提取的RNA，確證所提取樣本RNA質(zhì)量達(dá)到要求，如表1所示。采用高通量人類表觀轉(zhuǎn)錄組芯片檢測(cè)得到mRNA mA甲基化修飾譜，設(shè)置閾值為|FC|≥2且

P

＜0.05，篩選獲得GMA組和DMSO對(duì)照組間mA修飾水平差異的mRNA，結(jié)果以熱圖形式顯示（圖1）。與DMSO組比較，GMA組細(xì)胞中mA修飾水平差異的mRNA共有454個(gè)，其中高甲基化水平的mRNA 334個(gè)、低甲基化水平的mRNA 120個(gè)。

表1 GMA組和DMSO組細(xì)胞RNA提取質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

圖1 GMA誘導(dǎo)16HBE第30代細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中m6A修飾水平異常的mRNA

2.2 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)水平異常的mRNA

采用高通量人類表觀轉(zhuǎn)錄組芯片檢測(cè)結(jié)果，以轉(zhuǎn)錄本中修飾RNA和未修飾RNA的總量計(jì)算mRNA的表達(dá)水平，共有3 8647個(gè)mRNA。設(shè)置閾值為FC≥2且

P

＜0.05，篩選得到GMA組和DMSO對(duì)照組間差異表達(dá)的mRNA，結(jié)果以散點(diǎn)圖形式顯示（圖2）。與DMSO對(duì)照組比較，GMA組細(xì)胞中差異表達(dá)的mRNA共有434個(gè)，其中高表達(dá)水平mRNA為236個(gè)，低表達(dá)水平mRNA為198個(gè)。

圖2 GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)水平異常的mRNA

2.3 惡性轉(zhuǎn)化的16HBE細(xì)胞中m6A修飾mRNA的GO富集分析和KEGG通路分析

GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中mRNA mA修飾水平與其表達(dá)水平進(jìn)行聯(lián)合分析，結(jié)果如圖3所示，mA修飾的mRNA共有45個(gè)。GO富集分析顯示，mA修飾mRNA主要富集于SNAP受體活性、SNARE結(jié)合、SNARE復(fù)合體等，具體見表2；KEGG通路分析顯示，以上基因主要富集于囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接、苯丙氨酸代謝通路（表3）。

表2 m6A修飾mRNA的GO數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析結(jié)果（前10項(xiàng)）

表3 m6A修飾mRNA的KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析結(jié)果

圖3 mRNA m6A修飾水平與其表達(dá)水平的聯(lián)合分析

3 討論

表觀遺傳是在不改變DNA基本序列的前提下通過調(diào)控基因組與環(huán)境之間的相互作用而調(diào)控基因表達(dá)的可遺傳或可繼承機(jī)制的統(tǒng)稱，表觀遺傳異常被認(rèn)為是最重要的致癌機(jī)制之一，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、RNA修飾等。所有RNA修飾中，mA修飾是真核生物RNA中最常見也是分布最廣泛的表觀轉(zhuǎn)錄修飾。mA修飾由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如METTL3和METTL14等）催化形成，由去甲基酶（如FTO和ALKBH5等）去除，并經(jīng)mA結(jié)合蛋白（如YTHDF1和IGF2BP1等）識(shí)別來(lái)發(fā)揮功能。對(duì)真核生物中mRNA mA修飾的研究發(fā)現(xiàn)，mA修飾與mRNA的剪接、降解、翻譯及環(huán)狀RNA翻譯等生物學(xué)過程密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSCs）中表達(dá)上調(diào)，通過增加干性基因

SOX2

mRNA的穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)GSCs干性維持和放療抵抗。METTL14可能通過促進(jìn)抑癌因子pri-miR-126和DGCR8的結(jié)合，抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)mRNA mA修飾的研究將有助于揭示GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳機(jī)制。本研究利用高通量人類表觀轉(zhuǎn)錄組芯片對(duì)GMA誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞及同代齡對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和篩選，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞間mA修飾水平差異的mRNA共有454個(gè)，表達(dá)水平差異mRNA共有434個(gè)，進(jìn)一步對(duì)mRNA甲基化水平與其表達(dá)水平聯(lián)合分析，獲得mA修飾的mRNA，提示GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中mRNA mA修飾可能發(fā)揮重要作用。

通過GO富集分析和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)mA修飾mRNA富集于SNAP受體活性、SNARE結(jié)合、SNARE復(fù)合體等相關(guān)的基因功能，以及囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接、苯丙氨酸代謝等通路中。SNARE蛋白介導(dǎo)分泌囊泡與質(zhì)膜的錨定、融合，是真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)膜融合的關(guān)鍵因子，參與多種細(xì)胞功能。Meng等發(fā)現(xiàn)SNARE蛋白參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。SNARE蛋白syntaxin4（STX4）通過與Munc18c蛋白相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲偽足形成和細(xì)胞外基質(zhì)侵襲。He等發(fā)現(xiàn)STX4在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。在畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外STX4激活F9細(xì)胞分化程序，從而影響細(xì)胞黏附特性。SNARE相關(guān)通路是參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的重要信號(hào)通路，本研究結(jié)果提示其可能通過mA修飾參與GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程。通過各種DNA修復(fù)機(jī)制對(duì)細(xì)胞遺傳損傷及維持基因組穩(wěn)定性作出響應(yīng)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。通路分析富集到的另一通路非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），是指在不依賴DNA同源性的情況下，在一些修復(fù)元件的參與下將斷裂兩端的DNA直接連接的修復(fù)過程，是真核生物的主要修復(fù)方式。其中，X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因4（X-ray repair cross complementing protein 4，XRCC4）在NHEJ通路中發(fā)揮著重要作用，是維持基因組穩(wěn)定性的重要基因。研究表明，XRCC4的遺傳多態(tài)性與乳腺癌、食管癌、宮頸癌等多種癌癥易感性相關(guān)。基于表觀轉(zhuǎn)錄組芯片結(jié)合生物信息學(xué)方法分析得到與GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系密切的基因功能信息，尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證，但本研究結(jié)果的部分內(nèi)容與已發(fā)表文獻(xiàn)相符，提示本研究獲得的通路及基因功能信息具有研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，本研究使用高通量芯片檢測(cè)GMA誘導(dǎo)16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，得到mA修飾的mRNA，結(jié)合GO富集分析和KEGG通路分析，推測(cè)這些mRNA可能通過mA修飾經(jīng)囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用、非同源末端連接等通路在GMA誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。