Keratino Sens試驗在醫(yī)療器械致敏性檢測中的應用研究

陳 虹，黃元禮，王 涵，連 環(huán)，韓倩倩，王春仁

（中國食品藥品檢定研究院，北京 102629）

近年來利用人源細胞系來檢測人體皮膚過敏源的體外試驗方法日趨成熟，發(fā)展以人源細胞為基礎的體外檢測系統(tǒng)能最大化模擬人類皮膚致敏過程。皮膚中主要的免疫細胞是朗格漢斯細胞，但最先與應用于局部皮膚的化合物接觸的是角質(zhì)細胞，角質(zhì)細胞參與免疫反應并產(chǎn)生許多細胞因子。角質(zhì)細胞衍生的腫瘤壞死因子α在朗格漢斯細胞遷移的起始過程起了重要作用；同樣，角質(zhì)細胞也是IL-18的重要來源，IL-18是朗格漢斯細胞遷移誘導的關鍵調(diào)節(jié)因子。某些皮膚致敏物并不能與蛋白質(zhì)直接反應，而只能作為前抗原（通過代謝活化成抗原）參與致敏，由于角質(zhì)細胞具有內(nèi)部的代謝活化作用使得角質(zhì)細胞在致敏過程中成為一個重要的角色，因此基于人源角質(zhì)細胞的檢測方法——KeratinoSens試驗被開發(fā)應用。

KeratinoSens試驗由Givaudan公司開發(fā)，已于2015年被經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）采納為TG 442D指南文件。其原理是利用化學致敏物固有親電性（或具備通過代謝將其轉(zhuǎn)化為親電性化學產(chǎn)品的能力），與皮膚中蛋白質(zhì)反應后形成半抗原復合物，觸發(fā)Nrf2-Keap1-ARE信號通路。構(gòu)建含熒光素酶報告基因的KeratinoSens細胞系，在ARE控制下受誘導表達，其誘導表達程度通過測量熒光素酶與熒光底物反應得到的相對光輸出量來確定。

構(gòu)建細胞系的技術(shù)路線是首先合成人類

AKR1C2

基因ARE元件的兩條互補DNA單鏈，將兩條單鏈退火連接后接入載體pGL3的

Kpn

I和

Bgl

II兩位點之間。隨后將目標片段連同啟動子SV40一同從載體pGL3上使用限制性內(nèi)切酶切下，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III兩位點之間，篩選回收后得到目標質(zhì)粒并記為pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。將目標質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人永生化角質(zhì)細胞HaCaT細胞中，用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系記為KeratinoSens細胞系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HaCaT細胞，購于北京協(xié)和細胞資源中心；DH5α感受態(tài)細菌購于Solarbio公司。載體pGL3、pGL4.17、Bright-Glo熒光素酶檢測系統(tǒng)購于Promega公司，限制性內(nèi)切酶

Kpn

I、

Bgl

II、

Hin

d III購于NEB公司，α-MEM、PBS購于Hyclone公司，0.25%trypsin-EDTA、Opti-MEM購于Gibco公司，Lipofectamine2000、G418購于Invitrogen公司，凝膠DNA回收試劑盒購于AXYGEN公司，小量質(zhì)粒抽提試劑盒購于北京莊盟科技有限公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購于天根生化科技有限公司，Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司。脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，DOC）、三 氯 乙 酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷鎢酸（phosphotungstic acid，PTA），強致敏物二硝基氯苯（dinitrochlorbenzene，DNCB）、4-硝基芐溴（4-nitrobenzyl bromide）、對 苯 醌（p-benzoquinone），中等強度致敏物2-巰基苯并噻唑（2-mercaptobenzothiazole）、肉桂醛（cinnamic aldehyde）、β-大馬酮（β-damascone）以 及 弱 致 敏 物α-己 基 肉 桂 醛（αhexylcinnamaldehyde）、對 氨 基 苯 甲 酸 乙 酯（ethyl 4-aminobenzoate），非致敏物十二烷基硫酸鈉（SDS）均購自Sigma-Aldrich公司。

GloMax 96微孔板發(fā)光測試儀購于Promega公司，自動細胞計數(shù)儀購于Countstar公司，冷凍離心機、二氧化碳培養(yǎng)箱購于Thermo Fisher公司，紫外分光光度計購于Hitachi公司。

1.2 KeratinoSens細胞系的構(gòu)建和鑒定

1.2.1 KeratinoSens細胞系的構(gòu)建

合成含單個抗氧化元件（ARE）的兩條互補核苷酸單鏈（上游5′-CTGGTCGCAAGGTGTGCAAGCTGCTGAGTCACCCTGA CTGCATCAACCCCAGGAGCTA-3′；下游5′-GATCTA GCTCCTGGGGTTGATGCAGTCAGGGTGACTCAGCAGC TTGCACACCTTGCGACCAGGTAC-3′）。稀 釋 合 成 的DNA至20μL，使用上游引物、下游引物、10×NEBuffer 2各5μL，ddHO 10μL退火合成相應雙鏈DNA。利用

Kpn

I和

Bgl

II對pGL3載體進行雙酶切。雙酶切體系（30μL）包括：限制性內(nèi)切酶

Kpn

I和

Bgl

II各1.5μL、2μL載體pGL3、3μL NEBuffer 3.1、ddHO 22μL，于37℃反應4 h后置于冰上保存。將酶切后pGL3載體進行電泳及膠回收，按照凝膠DNA回收試劑盒（AXYGEN）說明回收DNA?；厥蘸蟮碾p酶切載體pGL3和退火的ARE片段進行連接，反應體系（10μL）包括：1μL酶切后載體pGL3、2μL退火產(chǎn)物、2μL T4 buffer、1μL T4 ligase、4μL ddHO，室溫下混勻，靜置過夜，得pGL3連接產(chǎn)物。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化篩選后，挑取單克隆按照小量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進行質(zhì)粒小提并進行雙酶切電泳鑒定。雙酶切pGL3連接產(chǎn)物和載體pGL4.17，反應體系30μL：限制性內(nèi)切酶

Kpn

I和

Hin

d III各1.5μL、pGL3連接產(chǎn)物和載體pGL4.17各2μL、ddHO 20μL，3μL NEBuffer 2.1，37℃反應2 h后4℃保存，酶切后膠回收。將目標ARE片段連同啟動子SV40從pGL3-Promoter上使用限制性內(nèi)切酶切下后，接入pGL4.17的

Kpn

I和

Hin

d III兩位點之間，篩選回收后質(zhì)粒小提并測序，測序結(jié)果經(jīng)過PubMed比對工具BLAST與目的片段比對。將測序正確的小提質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化涂板并挑取單克隆菌落至100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃條件下在180～200 r/min的搖床上振蕩過夜。按質(zhì)粒大提試劑盒說明進行質(zhì)粒大提得到目標質(zhì)粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40。

使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40和對照載體pGL4.17轉(zhuǎn)染HaCaT細胞。使用G418篩選細胞，大約10 d后對照組轉(zhuǎn)染細胞全部死亡。得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆使用Promega Glomax光度計測量，挑取熒光誘導值比儀器上限低2～3個數(shù)量級的克隆株。該試驗挑取熒光讀數(shù)6位且細胞狀態(tài)良好的1株細胞進行擴增，得到KeratinoSens細胞系。采用此細胞系檢測致敏性的方法稱為KeratinoSens試驗。

1.2.2 KeratinoSens細胞系的鑒定

選取OECD 429附錄1和文獻[4]驗證的強致敏物二硝基氯苯、4-硝基芐溴、對苯醌，中等致敏化合物2-巰基苯并噻唑、肉桂醛、β-大馬酮，弱致敏物α-己基肉桂醛、對氨基苯甲酸乙酯及非致敏物十二烷基硫酸鈉，使用Givaudan的KeratinoSens試驗對待測物進行測試。計算陰性對照組的變異度，測試細胞株的穩(wěn)定性；對比試驗結(jié)果與文獻中上述待測物的致敏性能，得到KeratinoSens試驗的致敏預測性。

每組試驗細胞鋪4塊96孔板，其中3塊白色板用于熒光素酶試驗，1塊透明板用于MTT試驗。陰性對照使用含1%FBS培養(yǎng)基，陽性對照使用濃度為8 mmol/L的DNCB，每組試驗重復3次。待測物溶于DMSO制成濃度為100 mmol/L的溶液。然后用DMSO連 續(xù)2倍 稀 釋得 到0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25、50、100 mmol/L共10個濃度的樣品。10個濃度樣品均用含1%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋25倍。將濃度1×10/mL的KeratinoSens細胞，每孔100μL接種于白色96孔板。每孔再添加100μL不含G418的培養(yǎng)基。放置于37℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，使用150μL含1%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基置換。將50μL含1%胎牛血清培養(yǎng)基的不同濃度樣品添加到不同孔里，受試品終濃度從2～1 000μmol/L，DMSO終濃度1%。試驗保持相同培養(yǎng)條件下，6孔陰性對照，6孔陽性對照，4孔空白對照。樣品與細胞共孵育48 h后，使用PBS清洗細胞1～2遍。每孔添加50μL不含血清的培養(yǎng)基和50μL螢火蟲熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)液。室溫避光孵育5 min，隨后使用Promega Glomax光度計測試讀數(shù)。同時，MTT法測試細胞活力。

1.2.3 計算及判定標準

基因活性誘導倍數(shù)=最大誘導值平均值/陰性對照誘導平均值；細胞活力

V

=

A

/

A

×100%，其中

A

為樣品組吸光度平均值（扣除空白），

A

為對照組吸光度平均值（扣除空白）。

陽性化合物判定標準：在細胞活力大于70%時，有基因活性誘導倍數(shù)大于1.5；3組重復樣品中，有2組以上樣品判斷為陽性；3組樣品有相似的劑量反應曲線（隨著濃度增加至細胞毒水平，基因活性誘導增加；與陰性對照比較，1.5倍基因誘導對應的濃度值相差不超過濃度序列里相鄰兩個濃度），陽性對照組有明顯基因活性誘導倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生。按下式計算變異度（coefficient of variation，CV）。

細胞系穩(wěn)定性判定標準：陰性對照組基因活性誘導值變異度小于20%；每個樣品的劑量反應曲線有相似的趨勢；陽性對照有明顯的基因活性誘導倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生。

1.3 醫(yī)用外科手套致敏性檢測

1.3.1 蛋白抽提及濃度測量

樣品1為一次性使用滅菌橡膠外科手套（高邦，桂林紫竹乳膠制品有限公司），樣品2為一次性使用醫(yī)用橡膠檢查手套（AMMEX，越南制造），樣品3為一次性使用橡膠檢查手套（瑞京，北京瑞京乳膠制品有限公司）。膠乳手套參照醫(yī)療器械國家標準《GB/T 21870-2008天然膠乳醫(yī)用手套水抽提蛋白質(zhì)的測定》改進的lowry法抽提手套中水溶性蛋白。抽提液使用PBS。于25℃的條件下，恒溫搖床以低速振蕩抽提4 h。按照Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒說明書測試待測樣品，使用紫外分光光度計在562 nm波長下檢測蛋白濃度。

1.3.2 手套抽提蛋白KeratinoSens試驗

超凈臺內(nèi)無菌條件取3個手套樣品的可溶蛋白抽提液。分別取抽提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens試驗加入96孔板相應的試驗孔中，并補充含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液至每孔200μL，每孔FBS終濃度均為1%。放置于37℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出測試。

1.4 金屬鎳致敏性檢測

1.4.1 鎳浸提及濃度測量

含鎳金屬參照醫(yī)療器械國家標準《GB/T 16886.12-2017醫(yī)療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照樣品》進行浸提，樣品1為正畸絲（3M，鎳含量40%～50%），樣品2為鎳鈦合金記憶合金棒（杭州啟明醫(yī)療器械有限公司，經(jīng)皮介入心臟瓣膜系統(tǒng)，鎳含量40%～50%），樣品3為鎳粉200目（國藥集團化學試劑有限公司）。

將3種樣品各稱量2 g，樣品滅菌后用10 mL含2%雙抗的MEM培養(yǎng)基浸泡于15 mL離心管中。離心管滅菌密封后，置于37%恒溫水浴搖床浸提，鎳粉浸提3 d，其余兩種浸提90 d。

配制濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/mL的系列鎳標準溶液。在232 nm波長下使用火焰原子吸收分光光度計繪制標準曲線，測量3份樣品鎳含量。

1.4.2 鎳浸提液KeratinoSens試驗

超凈臺內(nèi)無菌條件取金屬鎳樣品浸提液上清。分別取鎳浸提液20、40、60、80和100μL，依次按照本研究KeratinoSens試驗加入96孔板相應的試驗孔中，并補充含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液至每孔200μL，F(xiàn)BS終濃度均為1%。放置于37℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出檢測。

2 結(jié)果

2.1 KeratinoSens細胞系鑒定結(jié)果

2.1.1 不同能力致敏物檢測結(jié)果

高、中、低3種不同致敏力致敏物及1種非致敏物的KeratinoSens試驗測試結(jié)果見圖1。按照判定標準，基因活性誘導倍數(shù)大于1.5時，滿足細胞活性大于70%，可判定為陽性；1種非致敏物，無基因活性誘導倍數(shù)大于1.5的情況發(fā)生，判定為陰性。與人類斑貼測試文獻相比，結(jié)果預測全部正確。

圖1 不同能力致敏物KeratinoSens試驗結(jié)果

2.1.2 變異度計算結(jié)果

經(jīng)計算本試驗9個樣品陰性對照組的平均變異度為18.6%，符合穩(wěn)定性的要求。

2.2 天然膠乳手套致敏性檢測結(jié)果

2.2.1 天然乳膠手套水溶性蛋白抽提濃度

3份手套樣品水溶蛋白濃縮5倍后紫外分光光度計檢測，經(jīng)換算得到原始濃度，手套樣品1濃度為0.008 mg/mL，樣品2為0.008 mg/mL，樣品3為0.004 mg/mL。

2.2.2 天然乳膠手套浸提液KeratinoSens試驗結(jié)果

3份手套樣品KeratinoSens試驗檢測結(jié)果見圖2，基因活性誘導均無大于1.5倍情況發(fā)生，判斷為陰性。

圖2 3種天然膠乳手套KeratinoSens試驗結(jié)果

2.3 含鎳金屬致敏性檢測結(jié)果

2.3.1 金屬鎳離子濃度結(jié)果

經(jīng)檢測鎳粉浸提液鎳離子濃度較高，正畸絲和瓣膜材料合金鎳離子濃度近似且較低。鎳離子濃度檢測結(jié)果分別為鎳粉156.7mg/L、正畸絲0.984 mg/L、瓣膜材料合金小于標線最低濃度點。

2.3.2 金屬鎳KeratinoSens試驗結(jié)果

3份不同鎳離子濃度浸提液KeratinoSens試驗檢測結(jié)果（圖3）近似，基因活性誘導均無大于1.5倍情況發(fā)生，判斷為陰性。

圖3 3種含鎳金屬浸提液KeratinoSens試驗結(jié)果

3 討論

本研究采用致敏物通過基因活性誘導1.5倍值做定性判斷，在定量判斷區(qū)分致敏物的強弱時，有文獻提到強致敏物基因誘導1.5倍對應的化合物濃度一般小于10μmol/L；弱致敏物對應濃度一般大于50 μmol/L。如果以上可以作為一種定量標準，強致敏物4-nitrobenzyl bromide的基因活性誘導1.5倍對應濃度約為16 mmol/L，應被判定為中等致敏物；而中等致敏物β-damascone的基因活性誘導1.5倍對應濃度小于2 mmol/L，應被判定為強致敏物，其余化合物的判定與其致敏力基本相符。

KeratinoSens試驗使用水相系統(tǒng)，對于無法溶解在適當溶劑的脂溶性化學物質(zhì)很難正確評價。樣品不溶或無法形成穩(wěn)定的分散液會使得化學品難于在最高濃度測試。所以使用該系統(tǒng)評價的陽性結(jié)果可被識別為致敏劑，但陰性結(jié)果不能作為準確結(jié)論。OECD 442D也指出，選擇性與賴氨酸殘基反應的致敏物使用該方法也可產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

一項由2 738例樣本對天然膠乳IV型超敏反應的多中心研究結(jié)果顯示，天然乳膠手套可引起IV型超敏反應。天然膠乳中水溶性蛋白質(zhì)的總殘留量與過敏反應出現(xiàn)的頻率及嚴重性成正相關關系，其含有的水溶性蛋白質(zhì)是引起過敏的主要因素。手套樣品結(jié)果測試為陰性，尚需進一步研究。

有研究顯示，在金屬鎳導致皮膚致敏的過程中，伴隨活性氧離子將低價態(tài)二價的鎳離子（Ni）氧化為Ni和Ni。說明鎳的化學價態(tài)和微環(huán)境也是鎳金屬致敏的影響因素，推測鎳反應陰性可能由于模擬金屬鎳致敏微環(huán)境不充分，導致結(jié)果為陰性。

由于致敏機制復雜，涉及樹突狀細胞、角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞相互作用，單獨的體外測試無法覆蓋致敏的全部步驟，也可能是導致天然膠乳和金屬鎳反應呈陰性的原因。已有文獻使用包含Keratino Sens試驗的組合策略對213種化合物進行測試，結(jié)果顯示與人類斑貼試驗數(shù)據(jù)比較，準確率高達90%。綜上所述，我們認為可進一步使用組合策略對此兩種醫(yī)療器械進行測試以觀察效果，為KeratinoSens試驗應用于醫(yī)療器械的致敏性檢測提供經(jīng)驗數(shù)據(jù)。