Orai1對鼻咽癌細(xì)胞侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制

郭照萌，張 華，張 鵬

（深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院耳鼻咽喉科/深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東 深圳 518172）

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜的上皮性癌，并表現(xiàn)出明顯的地理差異，70%的新發(fā)病例報(bào)告在東亞和東南亞。隨著治療技術(shù)的發(fā)展，鼻咽癌的發(fā)病率和死亡率在過去的幾十年呈下降趨勢。但是由于鼻咽癌固有的侵襲性和隱匿性，60%～70%鼻咽癌患者被診斷時(shí)已是晚期，治療效果不佳。到目前為止，對于晚期鼻咽癌尚無有效的靶向治療方法。因此探討鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找鼻咽癌的治療靶點(diǎn)具有重大意義。Orai1是鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的關(guān)鍵分子。近年研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Orai1異常表達(dá)，并且對維持腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、侵襲等惡性表型有重要作用。然而，Orai1是否參與鼻咽癌的進(jìn)展過程仍未闡明。本研究主要探討了Orai1對鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，以期為鼻咽癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司；重組表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rEGF）、TRIzol、Lipofectamine3000和Fluo-4 AM購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司；PrimeScript?RT Reagent Kit和TB GreenFast qPCR Mix購于日本TaKaRa公司；角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、Orai1抗體和Thapsigargin購于美國Sigma公司；E鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N鈣黏蛋白（Ncadherin）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2、HONE1和5-8F以及人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69保藏于深圳市耳鼻咽喉研究所。人鼻咽癌細(xì)胞系用含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，人鼻咽上皮細(xì)胞系用含rEGF的角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，在CO體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靶向Orai1的2種shRNA，Orai1 shRNA-1（5′-CGTGCACAATCTCAACT CG-3′）和Orai1 shRNA-2（5′-CCAGCATTGAGTGTGT ACA-3′），以及對照質(zhì)粒（無意義序列）均由北京協(xié)和藥物所王艷博士饋贈。應(yīng)用Lipofectamine3000試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

TRIzol提取細(xì)胞總RNA，然后用PrimeScript?RT Reagent Kit轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR：95℃、5 min；95℃、60 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。引物序列：Orai1上游5′-GCCCTTCGGCCTGATCTTTAT-3′，下游5′-TGGAACTGTCGGTCAGTCTTAT-3′；E-cadherin上 游5′-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3′，下游5′-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3′；N-cadherin上游5′-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3′，下游5′-GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3′；Vimentin上游5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3′，下 游5′-ATC TGGCGTTCCAGGGACTCAT-3′；ACTB上游5′-CACC ATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游5′-AGGTCTTTG CGGATGTCCACGT-3′。以ACTB為內(nèi)參，采用2法計(jì)算相對表達(dá)水平。

1.2.3 Western blot

分別提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白加入上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。以每泳道20μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V、30 min，120 V、100min。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，100 V、90 min。電轉(zhuǎn)后PVDF膜用5%BSA室溫孵育60 min，孵育相應(yīng)蛋白的抗體，置于4℃冰箱內(nèi)搖床過夜。翌日TBST洗滌PVDF膜3次后，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育120 min，TBST洗滌PVDF膜3次后，加入ECL顯影液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.2.4 鈣庫調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)流檢測

為明確Orai1的表達(dá)變化對鼻咽癌細(xì)胞鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的影響，采用轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA和對照shRNA后檢測鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子的內(nèi)流。操作步驟為：用臺式液配制的4μmol/L Fluo-4 AM于培養(yǎng)箱中避光孵育細(xì)胞30 min，臺氏液洗滌3次后，用無鈣離子的臺氏液配制的4μmol/L thapsigargin孵育細(xì)胞15 min，加入2 mmol/L鈣離子觀察鈣離子內(nèi)流。Fluo-4熒光信號用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置入Transwell小室，取1×10/mL細(xì)胞懸液200μL接種在Transwell小室上層，然后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16 h后取出Transwell小室，用棉簽去除小室上層未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，然后在4%多聚甲醛中固定15 min。再將小室置于結(jié)晶紫染液中染色，拍照。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶8體積比稀釋后包被Transwell小室上層，然后置于37℃培養(yǎng)箱中30 min。后續(xù)操作同1.2.5。

1.2.7 EMT標(biāo)志蛋白的檢測

EMT可促進(jìn)癌細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附，導(dǎo)致細(xì)胞脫離、遷移和侵襲。為明確Orai1是否影響鼻咽癌細(xì)胞EMT，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染Orai1shRNA和對照shRNA后CNE2細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白Ecadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白的表達(dá)水平，具體操作方法同1.2.2和1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 Orai1 shRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中Orai1的表達(dá)水平

結(jié)果表明（圖1），Orai1在鼻咽癌細(xì)胞系及鼻咽上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且CNE2細(xì)胞系中Orai1的mRNA和蛋白表達(dá)水平較NP69細(xì)胞均顯著升高（

P

＜0.05），因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇CNE2細(xì)胞進(jìn)行。

圖1 Orai1 mRNA和蛋白在鼻咽細(xì)胞中的表達(dá)

CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA后，采用qPCR和Western blot方法檢測Orai1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，見圖2。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染對照shRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA的細(xì)胞中Orai1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。Orai1 shRNA-1與Orai1 shRNA-2效果相似，后續(xù)選擇Orai1 shRNA-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染（EMT實(shí)驗(yàn)除外）。

圖2 敲減CNE2細(xì)胞中Orai1的表達(dá)

2.2 Orai1對鼻咽癌細(xì)胞鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的影響

結(jié)果表明，敲減Orai1的表達(dá)后可顯著降低鈣庫調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見圖3。此結(jié)果表明降低Orai1的表達(dá)可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞鈣庫調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)流。

圖3 敲減Orai1表達(dá)后對CNE2細(xì)胞鈣庫調(diào)節(jié)的鈣內(nèi)流的影響

2.3 Orai1對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響

Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，與轉(zhuǎn)染對照shRNA組相比，轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA的CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著降低（

P

＜0.05）。另外，我們采用加入了Matrigel的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染對照shRNA組相比，CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA后細(xì)胞侵襲能力顯著被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見圖5。

圖4 敲減Orai1表達(dá)后對CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

圖5 敲減Orai1表達(dá)后對CNE2細(xì)胞侵襲的影響

2.4 Orai1對鼻咽癌細(xì)胞EMT的影響

結(jié)果如圖6所示，CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA-1和-2均可顯著抑制N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平（

P

＜0.05），增加E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平（

P

＜0.05）。提示降低Orai1的表達(dá)可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞的EMT。

圖6 敲減Orai1表達(dá)后對CNE2細(xì)胞EMT的影響

3 討論

鼻咽癌的病因包括遺傳因素、環(huán)境因素和EB病毒感染等。雖然放射治療和化學(xué)治療是鼻咽癌強(qiáng)有力的治療策略，但大多數(shù)鼻咽癌患者在早期診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，阻礙了有效治療，導(dǎo)致復(fù)發(fā)頻繁。因此，加深對鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的理解有助于發(fā)掘新型轉(zhuǎn)移靶向治療，改善鼻咽癌患者的預(yù)后。雖然Orai1被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要因素，但其在鼻咽癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究證實(shí)Orai1影響鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲，并可能與EMT相關(guān)。因此，研究Orai1調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，將為早期干預(yù)鼻咽癌轉(zhuǎn)移提供新的方向。

雖然近年來對腫瘤轉(zhuǎn)移的認(rèn)識有了較大的進(jìn)展，但鈣離子在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。鈣離子是一種多功能的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生理和病理過程。鈣離子通過鈣調(diào)素或其他鈣結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶活性和蛋白間的相互作用。鈣庫調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)流（store-operated Caentry，SOCE）是鈣離子進(jìn)入非興奮性細(xì)胞的主要方式之一。Orai1是一種位于細(xì)胞膜上的鈣通道蛋白，在哺乳動物細(xì)胞調(diào)控SOCE中發(fā)揮重要作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣儲存耗盡后，會激活Orai1，使鈣離子快速而短暫地流入細(xì)胞質(zhì)。Orai1作為SOCE的重要組成部分，研究表明Orai1促進(jìn)黑色素瘤、乳腺癌和腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，我們前期的研究亦表明Orai1在缺氧微環(huán)境下通過調(diào)節(jié)SOCE促進(jìn)乳腺癌的遷移。Orai1在多種腫瘤中高表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、食管癌和胃癌。我們的研究結(jié)果與之前的報(bào)道一致，在本研究中發(fā)現(xiàn)Orai1在鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2、HONE1和5-8F中的表達(dá)明顯高于人鼻咽上皮細(xì)胞NP69。這些結(jié)果提示Orai1可能參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。最近的研究表明，SOCE在各種惡性腫瘤進(jìn)展中起著重要作用。為了驗(yàn)證Orai1在鼻咽癌細(xì)胞中調(diào)控SOCE的作用，我們選擇靶向Orai1的特異性shRNA降低Orai1在CNE2細(xì)胞中的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減Orai1的表達(dá)可以顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞鈣庫調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)流。提示Orai1可能是調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞惡性發(fā)展的關(guān)鍵因子，并且在鼻咽癌細(xì)胞中正向調(diào)控SOCE。為了證實(shí)Orai1調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞侵襲的作用，我們通過轉(zhuǎn)染Orai1 shRNA抑制鼻咽癌細(xì)胞中Orai1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲受到抑制，說明抑制Orai1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，提示Orai1可能通過SOCE調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

鼻咽癌的死亡率主要是由于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤向局部淋巴及遠(yuǎn)處器官的侵襲和轉(zhuǎn)移。多數(shù)實(shí)體癌起源于上皮細(xì)胞，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是上皮細(xì)胞獲得運(yùn)動能力的重要過程。盡管EMT最初是在胚胎發(fā)育期間被發(fā)現(xiàn)，但越來越多的研究表明EMT可導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的獲得和上皮標(biāo)記物的丟失，進(jìn)而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。研究表明，E-cadherin調(diào)控細(xì)胞黏附，低表達(dá)E-cadherin促進(jìn)細(xì)胞脫離原位點(diǎn)，相反，N-cadherin和Vimentin與腫瘤侵襲性增加呈正相關(guān)，而這一過程已被證明與鈣離子內(nèi)流有關(guān)。鈣離子作為第二信使通過影響各種基因、蛋白質(zhì)和信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)多種類型的癌細(xì)胞中鈣離子通道和參與鈣離子穩(wěn)態(tài)的分子具有顯著的表達(dá)失調(diào)。研究顯示，Orai1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，降低Orai1可抑制胃癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移。降低前列腺癌PC-3細(xì)胞的Orai1表達(dá)，可顯著抑制EMT以及細(xì)胞運(yùn)動、遷移及侵襲能力。但是Orai1在鼻咽癌細(xì)胞EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)移中是否發(fā)揮作用，依然不明確。本研究得到了相似的結(jié)果，在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中降低Orai1的表達(dá)后，E-cadherin的表達(dá)降低，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)升高，抑制鼻咽癌細(xì)胞EMT。本研究結(jié)果提示降低Orai1表達(dá)可能通過抑制EMT過程，阻礙鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上所述，鼻咽癌細(xì)胞中Orai1呈高表達(dá)，降低Orai1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，其可能通過負(fù)調(diào)控SOCE和EMT發(fā)揮作用。因此，深入研究Orai1在鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，有望發(fā)掘鼻咽癌靶向治療的新靶點(diǎn)。