抗HIV藥物齊夫多定、拉夫米定和克力芝聯(lián)合用藥的急性經(jīng)口毒性和致突變作用

葛憲民，李 彬，黃超培*，高玉秋，羅海蘭，楊 慧，王彥武，溫平鏡，藍光華，陳歡歡，孟 琴，羅柳紅，鄧月琴，劉帥鳳，吳秀玲

（廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530028）

感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的育齡婦女可以在妊娠、分娩和哺乳階段將HIV傳播給嬰兒，這種母嬰傳播是導致我國近年15歲以下兒童感染HIV的主要原因。因此，采取有效措施阻斷HIV母嬰傳播（prevention of mother-to-child transmission，PMTCT）是控制HIV感染進一步擴散蔓延的關(guān)鍵。目前，以高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合治療的干預(yù)措施，已經(jīng)可使HIV母嬰垂直傳播率大幅降低，阻斷效果顯著；但在服藥過程中會出現(xiàn)一些藥物的不良反應(yīng)，如消化系統(tǒng)癥狀、肝腎毒性、骨髓抑制、高脂血癥和皮疹等。為了評價抗HIV聯(lián)合用藥的安全性，本文對抗HIV PMTCT的常用聯(lián)合藥物方案進行急性毒性和遺傳毒性研究。

1 材料與方法

1.1 受試物及處理

選擇目前較常用的抗HIV PMTCT用藥方案的聯(lián)合藥物，齊夫多定（zivdodine，AZT）、拉米夫定（lamivudine，3TC）和克力芝（kaletra，LPV/r）作為研究對象，3種藥均為片劑，其中AZT規(guī)格為520 mg/片（批號為AM18029），3TC為618 mg/片（批號為AZ19011），兩者每片的有效成分含量均為300 mg，均為上海迪賽諾生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品。LPV/r由德國AbbVie Deutschland GmbH&Co.KG公司生產(chǎn)，規(guī)格為1 250 mg/片（批號為1104498），每片含洛匹那韋200 mg和利托那韋50 mg。每日推薦孕產(chǎn)婦服用量為：AZT 2片+3TC 1片+LPV/r 2片，3種藥品的有效成分攝入量合計1 400 mg，按體質(zhì)量60 kg計算，折合劑量為23.3 mg/kg。試驗前，按上述比例將3種藥片混在一起，粉碎成粉末（有效成分含量為33.67%），密封保存?zhèn)溆?，臨用前用純水配成需要的濃度。

1.2 試驗動物與菌株

SPF級健康成年昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心繁殖，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002，合格證號：45000300000932/958。動物飼料由廣東省醫(yī)學實驗動物中心生產(chǎn)，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號：SYXK（桂）2016-0002。動物實驗室溫度為22～25℃，相對濕度55%～70%。鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535共5種菌株均購于美國MOLTOX公司，貯存于4℃冰箱，使用前經(jīng)生物特性鑒定符合試驗要求。

1.3 代謝活化系統(tǒng)及陽性物

肝微粒體酶S購自瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司，貯存于-70℃液氮中。陽性對照物2-氨基芴購自國藥集團化學試劑有限公司，敵克松購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，柔毛霉素購自加拿大TRC。

1.4 試驗方法

1.4.1 急性經(jīng)口毒性試驗

采用最大給藥量法，選體質(zhì)量為18～22 g的昆明種成年小鼠20只，雌、雄性各10只，試驗前禁食16 h，不限飲水。用純水將聯(lián)合藥物混合配成有效成分濃度為250 mg/mL的混懸液，然后按0.02 mL/g給小鼠灌胃1次，劑量為5 000 mg/kg（有效成分），灌胃后觀察、記錄小鼠的中毒表現(xiàn)和死亡情況，觀察14 d。

1.4.2 細菌回復(fù)突變試驗

采用平板摻入法，設(shè)50、158、500、1 581、5 000μg/皿（有效成分）5個劑量組，同時設(shè)自發(fā)回變對照（不加受試物）、陰性對照（純水）和陽性突變劑對照。用純水將聯(lián)合藥物配成相應(yīng)濃度的混懸液，經(jīng)過高壓滅菌（0.103 MPa作用20 min）處理后供試驗用。將試驗菌株增菌液0.1 mL、受試溶液0.1 mL（需代謝活化者再加入10%S混合液0.5 mL）依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基試管內(nèi)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，迅速均勻鋪開。每個劑量組的每種菌株設(shè)3個平行皿，在37℃恒溫培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿的回變菌落數(shù)并計算每組平均菌落數(shù)。當受試物回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系者為陽性結(jié)果。重復(fù)試驗1次。

1.4.3 哺乳動物體內(nèi)微核試驗

采用30 h兩次給受試物法，間隔24 h。設(shè)3個劑量組，分別設(shè)為500、1 000、2 000 mg/kg（有效成分），1個陰性對照組（等體積的純水）和1個陽性對照組（2 mg/mL環(huán)磷酰胺溶液）。每組10只小鼠，雌、雄性各半。用純水將聯(lián)合藥物分別配成有效成分濃度為25、50、100 mg/mL的混懸液，按0.02 mL/g分別給予試驗組動物灌胃。第2次給受試物后20 h處死動物，取股骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，經(jīng)甲醇固定和Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，每只動物計數(shù)2 000個嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocyte，PCE），微核率以含微核的PCE千分率表示。同時每只小鼠觀察200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞（normochromatic erythrocyte，NCE）的比值PCE/NCE。

1.4.4 哺乳動物精原細胞染色體畸變試驗

分組設(shè)計和處理同1.4.3。2 000 mg/kg劑量組10只雄性小鼠，其余組均為5只雄性小鼠，僅給藥1次。給予受試物后20 h，每組各取5只小鼠，按0.01 mL/g腹腔注射0.5 mg/mL的秋水仙素；給予受試物后44 h，以相同方法給2 000 mg/kg劑量組另5只動物注射秋水仙素。在注射秋水仙素4 h后，用頸椎脫臼法處死動物，取兩側(cè)睪丸。將睪丸放在1%檸檬酸三鈉中分離曲細精管，之后在甲醇/冰乙酸（3∶1，

V/V

）固定液中固定2次，在60%冰乙酸中軟化并打勻離心。將收集到的細胞混懸液滴于冰水冷卻的玻片上，制成2～3張片，經(jīng)Giemsa染色后在光學顯微鏡下鏡檢。每只動物計數(shù)100個中期分裂相細胞，觀察精原細胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變，記錄含染色體結(jié)構(gòu)畸變的細胞數(shù)，統(tǒng)計各組不同類型的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)目和頻率（染色體裂隙不計入畸變率）。

1.5 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，微核試驗中數(shù)據(jù)按Poisson分布的兩樣本均數(shù)比較法進行統(tǒng)計分析；染色體畸變試驗采用

χ

檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

給予5 000 mg/kg的聯(lián)合藥物后，小鼠的飲食和活動正常，14 d觀察期間小鼠的體質(zhì)量增長未受到明顯影響，未見中毒體征和死亡，試驗結(jié)束解剖小鼠，肉眼觀察主要器官組織未見異常病變，聯(lián)合藥物對小鼠的急性經(jīng)口毒性LD大于5 000 mg/kg。

2.2 細菌回復(fù)突變試驗

在加和不加S代謝活化系統(tǒng)的兩種條件下，各試驗菌株陽性對照組的回變菌落數(shù)均遠超自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，試驗體系可靠。聯(lián)合藥物各劑量組5種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)及陰性對照組的回變菌落數(shù)接近，且不存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，見表1。重復(fù)試驗的結(jié)果也與其一致，表明該聯(lián)合藥物未誘發(fā)試驗菌株基因突變。

表1 聯(lián)合藥物的細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果（±s，n=3）

2.3 體內(nèi)微核試驗

從表2可見，陽性對照組的微核率均高于陰性對照組（

P＜

0.01），各組的PCE/NCE值均在正常值（0.6～1.2）范圍且差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05），表明在本試驗劑量范圍未出現(xiàn)骨髓抑制作用，試驗體系可靠。聯(lián)合藥物各劑量組的微核率均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（

P＜

0.01），試驗結(jié)果為陽性。

表2 聯(lián)合藥物對小鼠骨髓細胞微核的影響

2.4 精原細胞染色體畸變試驗

結(jié)果見表3。陽性對照組可見染色體斷裂、斷片、微小體、環(huán)形等改變，染色體畸變細胞率顯著高于陰性對照組（

P

＜0.01），表明試驗體系可靠。聯(lián)合藥物各劑量組小鼠的精原細胞染色體的多倍體數(shù)目和染色體畸變類型（斷裂和裂隙），及畸變細胞率（畸變細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%）與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。

表3 聯(lián)合藥物對小鼠精原細胞染色體畸變率的影響（n=500）

3 討論

抗病毒藥物聯(lián)合治療是我國目前實行免費治療使用的HIV PMTCT治療方案，實行多年以來，已經(jīng)明顯降低HIV的母嬰傳播率，但不時有服藥后引起不良反應(yīng)的報道，如胃腸道反應(yīng)、疲乏、肝和腎臟毒性、骨髓抑制、皮疹等。為了評價聯(lián)合藥物AZT+3TC+LPV/r的安全性，本研究對該聯(lián)合藥物的急性毒性進行檢測，并采用體外細菌回復(fù)突變試驗、哺乳動物體內(nèi)骨髓細胞微核試驗和精原細胞染色體畸變試驗，研究該聯(lián)合藥物的致突變性。

在給予該聯(lián)合藥物后，小鼠未出現(xiàn)中毒體征和死亡，小鼠的急性經(jīng)口毒性LD大于5 000 mg/kg，表明聯(lián)合藥物無急性經(jīng)口毒性作用。體外試驗，在加和不加S代謝活化系統(tǒng)兩種條件下，該聯(lián)合藥物5個劑量組的5種試驗菌株的回變菌落數(shù)與自發(fā)回變的菌落數(shù)相接近，回復(fù)突變試驗結(jié)果為陰性。該聯(lián)合藥物3個劑量組雌、雄性動物的微核細胞率在4.4‰～5.2‰之間，與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01），并高出本實驗室的正常本底值（0.4‰～3.6‰），為陽性試驗結(jié)果，但試驗檢測結(jié)果顯示微核率與陰性對照組的微核率上限值5‰很接近，故其毒理學意義尚不確定。本試驗未觀察到受試物對骨髓的抑制作用（PCE/NCE比值未降低），與臨床觀察到的骨髓抑制不良反應(yīng)不一致，原因可能與用藥時間、劑量不同及種屬間敏感性差異等因素有關(guān)。微核率增高通常是受到染色體斷裂劑作用的結(jié)果，而骨髓抑制是化療藥物對骨髓的毒性反應(yīng)，兩者產(chǎn)生的機制不同，后者一般對粒細胞系影響最大，其次為血小板，而紅細胞系由于半衰期長，所以影響不明顯。該聯(lián)合藥物3個劑量組的精原細胞畸變細胞率與陰性對照組比較未見明顯增高，試驗結(jié)果為陰性。

綜上結(jié)果，聯(lián)合藥物AZT+3TC+LPV/r無急性經(jīng)口毒性作用，體外細菌回復(fù)突變試驗和小鼠精原細胞染色體畸變試驗結(jié)果均為陰性，而骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陽性，該聯(lián)合藥物的致突變性有待進一步探討和驗證。