氧化苦參堿對(duì)小鼠肉瘤和肝癌的體內(nèi)外抗腫瘤作用

劉 寧，梁蘭蘭，李淑芳，沈祥春，2，，梁 冰，

（1．貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2．貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）為喹嗪啶類生物堿，是傳統(tǒng)中藥苦參的主要藥效成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，近年來(lái)其抗腫瘤活性廣受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。本課題組前期觀察到氧化苦參堿對(duì)環(huán)磷酰胺抗S荷瘤小鼠的增效減毒作用，發(fā)現(xiàn)其與環(huán)磷酰胺合用可提高抑瘤率，緩解由環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞減少及肝損害。為進(jìn)一步了解氧化苦參堿的抗腫瘤作用，本研究采用S和H腫瘤細(xì)胞和荷瘤小鼠進(jìn)行了體內(nèi)、外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，以期為氧化苦參堿的臨床應(yīng)用及抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與儀器

氧化苦參堿（南京昆朗醫(yī)藥有限公司，經(jīng)本室純化OMT含量HPLC≥90%）。

XP-75型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；EXL800型酶標(biāo)儀（美國(guó)BLO-TEK公司）；CO培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；AB104-N型電子天平（梅特勒－托利多儀器/上海有限公司）；5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 動(dòng)物與瘤株

健康清潔級(jí)（SPF）昆明種小鼠220只，雌、雄各半，雌鼠體質(zhì)量18～22 g，雄鼠體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（黔2012－0001）。小鼠肉瘤細(xì)胞株S和小鼠肝癌細(xì)胞株H購(gòu)自重慶中藥研究所，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 氧化苦參堿對(duì)肉瘤S180和肝癌H22細(xì)胞增殖的影響[4]

采用四甲基噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期S和H細(xì)胞懸液按1×10個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下預(yù)培養(yǎng)24 h，S和H細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別設(shè)立空白對(duì)照組（RPMI-1640培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（不加藥的S和H細(xì)胞懸液）、5-氟尿嘧啶（5-FU，5×10g/L）陽(yáng)性對(duì)照組及5個(gè)不同濃度（1×10、1×10、1×10、1×10、1×10g/L）的氧化苦參堿培養(yǎng)組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入150μL DSMO，570 nm處檢測(cè)吸光度，按下列公式分別計(jì)算S和H細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4 氧化苦參堿對(duì)肉瘤S180和肝癌H22荷瘤小鼠移植瘤的影響[5]

于無(wú)菌條件下，分別將S和H瘤細(xì)胞接種于昆明種小鼠腹腔，7 d后抽取S和H荷瘤小鼠的腹水，與生理鹽水按體積比1∶4進(jìn)行稀釋，配置成瘤細(xì)胞懸液，活細(xì)胞率大于95%。接種于同種異體小鼠右前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10個(gè)），每次實(shí)驗(yàn)均用同一性別。小鼠造模24 h后，將造模小鼠均衡體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組，每組10只。即模型組，氧化苦參堿高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組，環(huán)磷酰胺（30 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組。另增設(shè)10只與造模組體質(zhì)量相當(dāng)?shù)奈唇臃N瘤細(xì)胞懸液的小鼠作為正常對(duì)照組，各組連續(xù)8 d灌胃給藥（正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積蒸餾水），每日1次。末次給藥后24 h，稱取小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死，剝離瘤體，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。取胸腺及脾臟，稱其濕質(zhì)量，計(jì)算胸腺系數(shù)和脾系數(shù)。

1.5 氧化苦參堿對(duì)S180和H22腹水型荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響

無(wú)菌條件下，腹腔分別注射S和H瘤細(xì)胞懸液于小鼠體內(nèi)，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10個(gè)細(xì)胞），共接種50只小鼠，分成5組，每組10只，次日均衡體質(zhì)量后，隨機(jī)分成模型組（蒸餾水），氧化苦參堿高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）劑量組，環(huán)磷酰胺（30 mg/kg）陽(yáng)性對(duì)照組，連續(xù)灌胃給藥8 d，每日1次。逐日記錄小鼠死亡情況，計(jì)算小鼠生命延長(zhǎng)率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿對(duì)肉瘤S180和肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用

隨著劑量的增加，氧化苦參堿（OMT）對(duì)S和H細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系（

r

=0.67，

r

=0.59，均為

P

＜0.05）。與模型組比較，1×10和1×10g/L的氧化苦參堿對(duì)S細(xì)胞和1×10g/L的氧化苦參堿對(duì)H細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率均大于30%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 氧化苦參堿（OMT）對(duì)肉瘤S180和肝癌H22細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 氧化苦參堿對(duì)S180和H22荷瘤小鼠移植性實(shí)體瘤的影響

與模型組比較，氧化苦參堿中、低劑量組能夠顯著抑制S荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率均＞30%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；氧化苦參堿高、中劑量組能夠顯著抑制小鼠肝癌H的生長(zhǎng)，抑瘤率均達(dá)到30%以上，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見(jiàn)表2和表3。

表2 氧化苦參堿（OMT）對(duì)S180荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響（±s，n=10）

表3 氧化苦參堿（OMT）對(duì)H22荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響（±s，n=10）

2.3 氧化苦參堿對(duì)S180和H22荷瘤小鼠胸腺系數(shù)和脾系數(shù)的影響

與正常組比較，氧化苦參堿各劑量組對(duì)S和H荷瘤小鼠胸腺和脾系數(shù)無(wú)明顯影響（

P

＞0.05）；環(huán)磷酰胺對(duì)照組S和H荷瘤小鼠胸腺和脾臟系數(shù)均明顯降低（

P

＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 氧化苦參堿（OMT）對(duì)S180和H22荷瘤小鼠胸腺系數(shù)和脾系數(shù)的影響（±s，n=10）

2.4 氧化苦參堿對(duì)S180和H22腹水型小鼠生存期的影響

與模型組比較，氧化苦參堿中劑量組可顯著延長(zhǎng)S腹水型小鼠的生存期，其生命延長(zhǎng)百分率為31.18%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 氧化苦參堿（OMT）對(duì)S 180和H22腹水型荷瘤小鼠生存期的影響（±s，n=10）

3 討論

惡性腫瘤仍是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)從天然植物中提取有效成分應(yīng)用于臨床惡性腫瘤治療已取得令人矚目的突破性進(jìn)展，是目前惡性腫瘤綜合治療的有效手段之一。我國(guó)幅員遼闊，地處亞熱帶及溫帶，植物資源豐富，從中藥特別是我國(guó)特有植物中研究、開(kāi)發(fā)抗腫瘤新藥早已成為廣大科研工作者的目標(biāo)之一。

氧化苦參堿具有較為廣泛的藥理活性，為研究其抗腫瘤作用，我們以S和H荷瘤小鼠為研究對(duì)象，觀察了氧化苦參堿的體內(nèi)外抗腫瘤作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，氧化苦參堿1×10和1×10g/L兩個(gè)濃度可明顯抑制小鼠肉瘤S細(xì)胞的增殖，其抑制率均大于30%，且隨著劑量的增加，氧化苦參堿對(duì)S細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。為進(jìn)一步明確其抗腫瘤作用，我們選取小鼠肉瘤S和肝癌H移植性腫瘤模型進(jìn)行了在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物移植瘤模型因具有造模時(shí)間短、接種成功率高、均一性好等特點(diǎn)，廣泛用于腫瘤基礎(chǔ)研究及藥物篩選，成為研究中醫(yī)藥抗腫瘤作用及機(jī)制的一個(gè)公認(rèn)的腫瘤模型。藥物對(duì)抗腫瘤是否有效，抑瘤率是經(jīng)典指標(biāo)之一。與模型組相比，氧化苦參堿高、中、低3個(gè)劑量組均可明顯抑制S肉瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為48.48%、41.67%和32.58%；氧化苦參堿高、中劑量組可顯著抑制肝癌H小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為33.95%和31.63%，抑瘤率均大于30%，符合抗癌藥篩選標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們注意到，采用氧化苦參堿治療的小鼠其飲食情況和活動(dòng)情況較采用環(huán)磷酰胺治療的小鼠要好。

從氧化苦參堿對(duì)生存期的影響來(lái)看，雖然高、低劑量組可在一定程度上延長(zhǎng)S腹水型荷瘤小鼠的生存時(shí)間，但只有中劑量組的生命延長(zhǎng)率大于30%，其余組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合抑瘤作用的結(jié)果分析，說(shuō)明中劑量組的氧化苦參堿對(duì)肉瘤S腫瘤細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，可作為將來(lái)進(jìn)一步抑瘤機(jī)制研究的參考劑量。

胸腺和脾臟是動(dòng)物重要的免疫器官，胸腺系數(shù)和脾系數(shù)的大小可反映機(jī)體免疫的機(jī)能狀況。氧化苦參堿給藥組胸腺和脾系數(shù)與模型組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)選用環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，該藥物是臨床上常用的腫瘤化療藥物，抑瘤作用強(qiáng)大，作用機(jī)制明確，但作為一種免疫抑制劑，臨床應(yīng)用時(shí)毒副作用較大。從動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，氧化苦參堿抑瘤效果雖不及環(huán)磷酰胺，但氧化苦參堿組的小鼠生存期較環(huán)磷酰胺組小鼠的生存期稍長(zhǎng)，且其對(duì)脾臟、胸腺系數(shù)無(wú)明顯影響，仍具有抗腫瘤作用，說(shuō)明氧化苦參堿的毒性小于環(huán)磷酰胺，這正是該藥物的優(yōu)勢(shì)所在。

綜上，體外和體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)顯示，氧化苦參堿具有一定的抗腫瘤作用，尚未發(fā)現(xiàn)其嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及對(duì)免疫器官的影響，說(shuō)明其具有潛在的臨床應(yīng)用前景，苦參作為祖國(guó)傳統(tǒng)中藥，其資源豐富，可作為一種前景較好的抗腫瘤藥進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)，但其確切的抑瘤機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。