鹽度脅迫對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚呼吸代謝和抗氧化酶活性的影響

杜佳玉 吳晗閱 孟照勇 李雪東 文遜智 王茂林

摘要 挑選平均體重（4.0±1.4）g、平均體長（8.0±1.2）cm的細(xì)鱗鮭（Brachymystax lenok）幼魚，研究了不同鹽度（0、6、12、18、24、30）對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中Na+-K+-ATP、抗氧化酶（SOD、CAT）活性的影響。結(jié)果表明，不同鹽度對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性及肝臟中抗氧化酶活性有顯著影響（P<0.05）。隨著鹽度的升高，細(xì)鱗鮭鰓絲和肝臟中的Na+-K+-ATP活性升高，抗氧化酶（SOD、CAT）的活性則隨著鹽度的升高而降低。雖然細(xì)鱗鮭能夠通過自身的滲透調(diào)節(jié)和抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外界鹽度變化帶來的壓力，但是長期的鹽度脅迫也會(huì)給細(xì)鱗鮭幼魚機(jī)體帶來損害。研究結(jié)果為今后細(xì)鱗鮭的耐鹽度選育、養(yǎng)殖推廣等方面的工作提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 鹽度脅迫;細(xì)鱗鮭幼魚;Na+-K+-ATP;SOD;CAT

中圖分類號(hào) S-917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）22-0114-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.22.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Salinity Stress on the Respiratory Metabolism and Antioxidant Enzyme Activities of Brachymystax lenok Juvenile

DU Jia-yu? WU Han-yue? MENG Zhao-yong 2 et al （1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North Chinas Sea，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023; 2. Key Laboratory of Applied Biology and Aquaculture of Fish in Northern China，Liaoning Province，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract Brachymystax lenok juvenile with the average body weight of （4.0±1.4） g and average body length of （8.0±1.2） cm were selected to study the effects of different salinity （0， 1 18，2 30） on the activities of Na+-K+-ATP and antioxidant enzymes （SOD，CAT） in the gill filament and liver of B.lenok juvenile.The results showed that different salinity had significant effects on the activity of Na+-K+-ATP in gill filaments and the activities of antioxidant enzymes in the liver of B.lenok juvenile（P<0.05）.With the increase of salinity，the activities of Na+-K+-ATP in gill filaments and liver increased，while the activities of SOD and CAT decreased with the increase of salinity gradient.Although B.lenok could deal with the pressure caused by the changes in external salinity through its own osmotic adjustment and antioxidant systems，long-term salinity stress could also cause the damages to the body of B.lenok juvenile.The research results provided certain theoretical basis for the future work on the selection of salinity tolerance，breeding and promotion of B.lenok.

Key words Salinity stress;B.lenok juvenile; Na+-K+-ATP;SOD;CAT

細(xì)鱗鮭隸屬于硬骨魚綱鮭形目鮭科細(xì)鱗鮭屬，一般分布于渭河上游及其支流和漢水北側(cè)支流湑水河、子午河上游的溪流中，常年水溫不宜超過20 ℃。細(xì)鱗鮭由于其肉質(zhì)細(xì)嫩，脂肪含量高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，細(xì)鱗鮭作為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，在魚類學(xué)和動(dòng)物地理學(xué)上也具有重要的學(xué)術(shù)研究價(jià)值 。細(xì)鱗鮭雖然屬于淡水魚類，但對(duì)鹽度具有一定的耐受性。鹽度是影響魚類生長發(fā)育和生理變化的重要因子[1-3]。鹽度脅迫會(huì)導(dǎo)致魚類機(jī)體的氧化酶和Na+-K+-ATP酶發(fā)生一定程度的改變。滲透調(diào)節(jié)的能力與Na+-K+-ATP酶有關(guān)，測(cè)定Na+-K+-ATP酶的活性可以了解魚類在鹽度脅迫下滲透調(diào)節(jié)的能力[4-8]。CAT和SOD等抗氧化酶具有清除機(jī)體自由基的功能，提高魚體的免疫調(diào)節(jié)能力[8-10]，因此研究鹽度脅迫對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚酶活性的影響，有利于了解細(xì)鱗鮭在鹽度改變時(shí)作出的應(yīng)對(duì)機(jī)制，提高細(xì)鱗鮭的健康養(yǎng)殖技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 細(xì)鱗鮭幼魚由本溪恒仁漁眾不同家庭農(nóng)場(chǎng)有限公司提供，均為人工繁育的細(xì)鱗鮭幼魚，在大連海洋大學(xué)愛尼實(shí)驗(yàn)室人工循環(huán)水槽中暫養(yǎng)3 d，養(yǎng)殖水溫為（7.0±0.3）℃，pH為（7.5±0.4）。每天24 h連續(xù)充氧保持富氧的環(huán)境。

1.2 預(yù)試驗(yàn)和試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將同一批次的幼魚置于鹽度為0（對(duì)照組）、6、12、18、24、30的循環(huán)水槽中，暫養(yǎng)24 h內(nèi)觀察細(xì)鱗鮭幼魚的狀態(tài)，計(jì)算幼魚的存活率。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)鱗鮭幼魚在0～30鹽度下均能存活。

選取在暫養(yǎng)條件下健康狀況良好的細(xì)鱗鮭幼魚，置于試驗(yàn)所需的循環(huán)水槽內(nèi)。緩慢調(diào)整鹽度梯度，每天提高水體的鹽度從2至30，保持24 h富氧環(huán)境。在0、6、12、18、24、30鹽度下取樣，每個(gè)鹽度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3 樣品的制備和采集 從每個(gè)鹽度下取3尾細(xì)鱗鮭幼魚，用MS-222麻醉劑麻醉后，取其肝臟和鰓絲。每尾魚的肝臟和鰓絲分為3份，將其分別置于預(yù)冷的離心管中，做好標(biāo)記后保存于超低溫冰箱中（-80 ℃）。樣品前處理：準(zhǔn)確稱取組織重量，按照組織重量（g）：生理鹽水體積（mL）=1∶9的比例配制成10%的勻漿，2 500 r/min（CAT活性測(cè)定時(shí)轉(zhuǎn)速為10 000 r/min）離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋成不同的濃度，探索最佳取樣濃度（組織的最佳取樣濃度按1%進(jìn)行）。測(cè)定Na+-K+-ATP酶和抗氧化物酶所需的試劑盒為南京建成生物工程研究所提供的SOD試劑盒、ATP試劑盒、CAT試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒，測(cè)定步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1

超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定。采用羥胺法測(cè)定超氧化物歧化酶活性。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，550 nm下比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，計(jì)算被測(cè)樣品的SOD活性。

1.4.2 過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定。過氧化氫酶在一定條件下使底物過氧化氫分解，使其在反應(yīng)液中的濃度逐漸降低，在240 nm處測(cè)定過氧化氫酶的活性。

1.4.3 Na+-K+-ATP活性測(cè)定。ATP酶可分解ATP，生成ADP和無機(jī)磷，在660 nm處測(cè)定無機(jī)磷的量，從而測(cè)定ATP活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，對(duì)測(cè)得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性分析采用Duncan多重比較，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中Na+-K+-ATP活性的影響

如圖1～2所示，除對(duì)照組（CK）外，隨著鹽度的增加，細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中Na+-K+-ATP活性呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組（鹽度為0）Na+-K+-ATP活性顯著高于鹽度為12時(shí)（P<0.05）;對(duì)照組Na+-K+-ATP活性為（6.32±0.39）U/g，是鹽度12時(shí)的1.86倍。除對(duì)照組外，隨著鹽度的增加，細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性呈上升趨勢(shì)，鹽度為0（CK）和30時(shí)Na+-K+-ATP活性顯著高于鹽度為6和12時(shí)（P<0.05）;鹽度30時(shí)肝臟中Na+-K+-ATP活性最高，為（2.95±0.34）U/g，是鹽度6時(shí)的2.78倍。試驗(yàn)初期當(dāng)鹽度發(fā)生變化時(shí)，

細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中的Na+-K+-ATP活性降低，但隨著鹽度的遞增，細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中的 Na+-K+-ATP活性回升，表明在鹽度梯度變化時(shí)Na+-K+-ATP酶參與細(xì)鱗鮭的滲透調(diào)節(jié)來維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2.2 不同鹽度對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中CAT活性的影響 如圖3～4所示，隨著鹽度的升高，細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中過氧化氫的含量增加，反映出CAT酶活性呈下降趨勢(shì)。當(dāng)鹽度為30時(shí)細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中H2O2含量最大，為（115.73±14.90）U/g，是對(duì)照組（CK）的9.59倍，是鹽度6時(shí)的2.32倍，這表明在鹽度為30時(shí)細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中CAT活性最低;細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中CAT活性差異顯著（P<0.05），隨著鹽度的增加，H2O2含量增加，反映出CAT活性呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組（鹽度0）與鹽度為6、12和18時(shí)細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中H2O2含量差異不顯著。鹽度為30時(shí)細(xì)鱗鮭幼苗肝臟中H2O2含量最大，為（63.28±7.27）U/g，是對(duì)照組的7.39倍，是鹽度18的8.25倍，這表明在鹽度為30時(shí)幼鱗鮭幼魚肝臟中CAT活性最低。

2.3 不同鹽度對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚肝臟和鰓絲中SOD活性的影響 如圖5～6所示，不同鹽度下細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中SOD活性差異不顯著（P>0.05），不同鹽度下細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性差異顯著（P<0.05）。隨著鹽度的增加，細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性最高，鹽度為30時(shí)細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性最低，對(duì)照組細(xì)鱗鮭幼魚肝臟中SOD活性是鹽度30時(shí)的1.5倍。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著鹽度的增加，細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲和肝臟中Na+-K+-ATP活性先降低再逐漸回升，SOD和CAT的活性隨著鹽度的增加而降低。在鰓絲中，Na+-K+-ATP酶在不同鹽度梯度下差異性比超氧化物歧化酶和過氧化氫酶高。鰓是魚類調(diào)節(jié)外界生活水域與體內(nèi)離子水平的重要器官，Na+、K+是鰓中最重要的調(diào)控離子，Na+-K+-ATP酶為Na+、K+離子調(diào)控提供動(dòng)力。因此，當(dāng)外界的鹽度梯度發(fā)生變化時(shí)，細(xì)鱗鮭幼魚鰓絲中Na+-K+-ATP活性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。細(xì)鱗鮭幼魚能夠通過自身的滲透調(diào)節(jié)、Na+-K+-ATP活性變化和抗氧化系統(tǒng)（主要是CAT、SOD），應(yīng)對(duì)外界鹽度變化帶來的壓力，但長期的鹽度脅迫也會(huì)給細(xì)鱗鮭幼魚機(jī)體帶來損害。

4 討論

魚類在適應(yīng)外界環(huán)境鹽度變化時(shí)會(huì)產(chǎn)生各種生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)的滲透壓和抗氧化酶活性的改變[11-12]。魚類為了維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定必須進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，魚類滲透壓調(diào)節(jié)的能力決定了其對(duì)鹽度的耐受能力。當(dāng)外界的鹽度發(fā)生改變，魚類可以通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP的活性來適應(yīng)外界環(huán)境的變化[13]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著鹽度的逐漸增加，Na+-K+-ATP活性的改變呈現(xiàn)出先降低后逐漸升高，最后恢復(fù)正常的趨勢(shì)。外界鹽度升高時(shí)，魚類體內(nèi)的鈉離子和氯離子需要進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，Na+-K+-ATP為細(xì)胞內(nèi)離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量[14]。研究表明，當(dāng)魚類遭受鹽度脅迫時(shí)，機(jī)體內(nèi)與滲透壓相關(guān)的Na+-K+-ATP會(huì)發(fā)生顯著變化，Na+-K+-ATP在機(jī)體滲透壓的調(diào)節(jié)和離子平衡上起到關(guān)鍵作用[15]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是評(píng)價(jià)魚類非特異性免疫的重要指標(biāo)，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中重要組成部分。當(dāng)鹽度升高時(shí)，魚體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的過氧化氫和超氧陰離子，這些活性氧會(huì)損傷魚類細(xì)胞，進(jìn)而對(duì)魚類的生理機(jī)能造成損傷[16]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以降低這些自由基對(duì)魚類細(xì)胞的損傷[17]。孫夢(mèng)蕾等[10]對(duì)紅鰭東方鲀肝臟中的SOD和CAT活性研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽脅迫下SOD和CAT的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。該試驗(yàn)結(jié)果表明，魚類在高鹽和低鹽脅迫下，其過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性均會(huì)增加，因此SOD和CAT的活性可反映魚類細(xì)胞的受損程度。王曉杰等[18]對(duì)許氏平鮋的研究表明許氏平鮋血液中的過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性隨鹽度的降低呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。該試驗(yàn)結(jié)果表明短期的鹽度梯度變化會(huì)使細(xì)鱗鮭幼魚抗氧化酶活性增高。

鹽度作為一種生態(tài)因子，通過改變魚類的滲透壓來影響魚類的呼吸、代謝和酶的活性。目前的研究表明對(duì)魚類的滲透調(diào)節(jié)已達(dá)到分子水平。有多種基因參與到魚類的滲透調(diào)節(jié)，跨膜蛋白基因（NKA基因）參與硬骨魚類滲透調(diào)節(jié)鈉離子運(yùn)輸?shù)幕钴S泵，調(diào)節(jié)鈉離子和氯離子的雙向載體交換蛋白基因（NHE基因）[19]。在薩羅羅非魚和尼羅羅非魚的腸道和鰓等組織中檢測(cè)出水通道蛋白的表達(dá)。水通道蛋白基因（APQs基因）不僅對(duì)水和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要作用，而且參與甘油和尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)魚類的滲透壓調(diào)節(jié)具有重要意義[19]。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，對(duì)魚類滲透壓調(diào)節(jié)的研究將進(jìn)入數(shù)據(jù)化、信息化時(shí)代。

參考文獻(xiàn)

[1]

王艷.低鹽脅迫對(duì)鱸魚（Lateolabrax japonicus）稚魚生長及生理生化指標(biāo)的影響[D].重慶：重慶師范大學(xué)，2008.

[2] 姜海濱，張靜，薛美巖，等.溫度和鹽度對(duì)塞內(nèi)加爾鰨幼魚存活及生長的影響[J].海洋湖沼通報(bào)，2011（1）：31-35.

[3] 郭勤單，王有基，呂為群.溫度和鹽度對(duì)褐牙鲆幼魚滲透生理及抗氧化水平的影響[J].水生生物學(xué)報(bào)，201 38（1）：58-67.

[4] NAVARRO J M.The effects of salinity on the physiological ecology of Choromytilus chorus （Molina，1782） （Bivalvia：Mytilidae）[J].Journal of experimental marine biology & ecology，1988，122（1）：19-33.

[5] 張晨捷，彭士明，王建鋼，等.鹽度對(duì)銀鯧（Pampus argenteus）Na+/K+-ATP酶活力及血清滲透壓調(diào)節(jié)激素濃度的影響[J].海洋與湖沼，201 44（5）：1395-1402.

[6] KIM W S，KIM J M，KIM M S，et al.Effects of sudden changes in salinity on endogenous rhythms of the spotted sea bass Lateolabrax sp.[J].Marine biology，1998，131（2）：219-225.

[7] 胡俊恒，班紅琴.鹽度對(duì)魚類的影響及魚類的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制[J].河北漁業(yè)，2010（8）：41-4 50.

[8] 魯耀鵬，錢坤，汪蕾，等.養(yǎng)殖鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶及免疫相關(guān)酶活力的影響[J].河北漁業(yè)，2019（12）：1- 28.

[9] 施兆鴻，張晨捷，彭士明，等.鹽度對(duì)銀鯧血清滲透壓、過氧化氫酶及鰓離子調(diào)節(jié)酶活力的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，201 37（11）：1697-1705.

[10] 孫夢(mèng)蕾，姜志強(qiáng)，蔣潔蘭，等.低鹽脅迫對(duì)紅鰭東方鲀幼魚肝臟的酶活性、組織結(jié)構(gòu)及免疫基因表達(dá)的影響[J].河北漁業(yè)，2017（4）：1-4.

[11] ROMANO N，ZENG C S.Osmoregulation in decapod crustaceans：Implications to aquaculture productivity，methods for potential improvement and interactions with elevated ammonia exposure[J].Aquaculture，201 334/335/336/337：12-23.

[12]

冉鳳霞，金文杰，黃屾，等.鹽度變化對(duì)魚類影響的研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，48（8）：10-18.

[13] 侯彥峰.青鳉魚鰓內(nèi)Na+-K+-ATPase基因的克隆及皮質(zhì)醇對(duì)其表達(dá)的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

[14] 劉珊，李冰，張成鋒，等.硬骨魚類滲透調(diào)控的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，201 39（20）：12239-1224 12245.

[15] HUANG M，ZHOU Y G，LIU C Y，et al.Fatty acid composition，osmolality，Na+，K+-ATPase activity，cortisol content and antioxidant status of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss） in response to various dietary levels of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid[J].Aquaculture research，2020，51（7）：2777-2789.

[16] 徐力文，劉廣鋒，王瑞旋，等.急性鹽度脅迫對(duì)軍曹魚稚魚滲透壓調(diào)節(jié)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（7）：1596-1600.

[17] 王思婷.鹽度對(duì)黑鯛抗氧化系統(tǒng)的影響及雜交鯛魚與親本的脂肪酸成分比較[D].南京：南京師范大學(xué)，2018.

[18] 王曉杰，張秀梅，李文濤.鹽度脅迫對(duì)許氏平鲉血液免疫酶活力的影響[J].海洋水產(chǎn)研究，200 ?26（6）：17-21.

[19] BLAIR S，LI X J，DUTTA D，et al.Rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）Na+/H+ exchangers tNhe3a and tNhe3b display unique inhibitory profiles dissimilar from mammalian NHE isoforms[J].International journal of molecular sciences，202 22（4）：1-17.