復合植物精油抑制飼料霉菌的效果研究

◆作者：周鵬 唐勝球 潘宇杰 董小英

◆單位：韶關學院英東生物與農(nóng)業(yè)學院

霉菌是真菌的一部分，在自然環(huán)境中分布廣泛，且種類繁多，最常見的霉菌有曲霉、青霉、鐮刀菌、麥角菌屬等。其中，霉菌中產(chǎn)生毒素最甚者為黃曲霉，黃曲霉能夠分泌黃曲霉毒素（AFT）B1、B2、G1、G2 等18 種，而黃曲霉中產(chǎn)毒素B1 是已經(jīng)被判定為毒性最強的物質(zhì)之一，其毒性比氰化鉀大10 倍，比砒霜大68倍。1993 年，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)劃定黃曲霉毒素為已知毒性極強的致癌化學物質(zhì)之一（李書國等，2009）。另有數(shù)據(jù)顯示，全世界平均每年因霉變而損失的糧食大約是其總產(chǎn)量的10%（劉國信，1999）。因此，預防霉菌帶來的危害，針對抑制霉菌生長的研究是十分必要的。

植物精油是由植物的葉、枝、根莖等原材料，經(jīng)過蒸餾等方法萃取出的具有芳香性氣味的物質(zhì)。植物精油作為一種天然的活性物質(zhì)，具有很強的殺菌抑菌、抗氧化以及增強機體免疫力等生物學功能（鄔本成等，2013）。國內(nèi)外研究表明，天然植物精油對常見的真菌如黃曲霉菌具有顯著的生長抑制作用，且部分精油對一些黃曲霉毒素有一定程度的降解作用（王萍等，2021）?，F(xiàn)有資料顯示，丁香、小茴香、大蒜、香菜、山蒼子和八角等植物都具有較強的抑菌作用，且具有諸多的藥理作用。如丁香和小茴香可抑制致病性真菌及葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等。山蒼子含有檸檬醛等活性成分，易與黃曲霉毒素等有害物質(zhì)發(fā)生分解、氧化等化學反應，是消除黃曲霉毒素最有效、最安全的物質(zhì)（曲春陽，2012；管志遠等，2005；李春美等，2004）。佟晶晶等（2018）證實，多種精油復合的效果比單一精油對特定細菌的抑制效果更強。此外，研究表明，天然植物精油作為防霉劑對動物飼養(yǎng)無毒害作用（Pereira 等，2014）。由此可見，植物作為飼料防霉劑具有一定研究意義，而復合植物配方精油更有可能具有好的防霉效果。因此，本實驗對部分天然植物精油的防霉作用進行研究，利用聯(lián)合抑菌效果評價方法，在所選植物精油篩選出對霉菌具有最佳抑菌效果的單方或復方精油的最佳配方。

2 材料和方法

2.1 實驗材料

植物：山蒼子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角。

霉菌：在實驗室從發(fā)霉玉米粉中提取并分離培養(yǎng)。

飼料：玉米粉。

土豆培養(yǎng)基：取新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。先將馬鈴薯洗凈，去皮后切成0.5 cm3的小塊煮沸15~20 min，然后用四層紗布過濾（佟晶晶等，2018），加入葡萄糖、瓊脂和蒸餾水至1000 mL，高溫滅菌20 min，留存?zhèn)溆谩?/p>

察氏培養(yǎng)基：實驗室自配（硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g）。

2.2 實驗方法

2.2.1 玉米粉中霉菌的分離培養(yǎng)

取適量玉米粉于培養(yǎng)皿中，放入溫度為40℃，濕度90%的培養(yǎng)箱中讓其霉變。待玉米粉霉變后，用接種環(huán)刮取適量霉菌放入培養(yǎng)皿中，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)兩天。

2.2.2 霉菌懸液的制備

用接種環(huán)挑取3-4 環(huán)（每個菌落扣一下）于10 mL 無菌管的無菌水中，采用顯微鏡直接計數(shù)法測出總菌數(shù)（血細胞計數(shù)板計數(shù)），然后制成106~107CFU/mL均勻霉菌懸液。

2.2.3 霉菌抑制試驗

參照濾紙片法（王加啟等，2003）。無菌條件下，將霉菌菌懸液0.1 mL 滴入察氏培養(yǎng)基，涂布均勻即含菌平板。將1 片直徑6mm的無菌濾紙片貼于含菌平板的皿內(nèi)中央，并使之展開。向濾紙片滴加精油，精油添加體積相等（20μL）。以添加無菌水的濾紙片為空白對照，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。細菌于37℃條件下恒溫培養(yǎng)20 h，霉菌于28℃條件下恒溫培養(yǎng)4-5 d。培養(yǎng)結(jié)束，用十字交叉法測量各抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。每組重復3 次。

參照抑菌圈試驗判定標準：抑菌圈直徑>18 mm 為高度敏感，10mm~18mm 為中度敏感，5mm~10 mm 為低度敏感。

2.2.4 最低抑菌濃度試驗

參照最低抑菌濃度MIC 試驗（胡俊，2001），將菌懸液0.1 mL滴入培養(yǎng)基中，涂布均勻即含菌平板。精油用0.22μm 的微孔過濾器過濾，并用tween-80 稀釋。吸取各稀釋液1 mL 于無菌條件下加入含菌平板的皿蓋中央，倒置培養(yǎng)，使培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中的精油濃度分別達到1~180 mg/L 空氣系列濃度（使細菌培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中精油濃度分別達到0.18000、0.09000、0.04500、0.02250、0.01125 mg/mL），以不生長菌的樣品的最低濃度為精油對該菌的氣相MIC，每個試驗重復3 次。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同植物來源精油對飼料霉菌的抑制效果

通過查閱大量的參考文獻與資料，選出了對霉菌有較好抑制作用的6 種植物，并對其蒸餾出山蒼子精油、丁香精油、小茴香精油、大蒜精油、香菜精油和八角精油。通過抑制圈直徑測定方法，篩選出具有較強抑制飼料霉菌活力的精油，抑制霉菌結(jié)果見表1。由表1 可知，精油對飼料霉菌的抑制效果為：山蒼子> 丁香> 小茴香> 大蒜> 香菜。丁香、山蒼子和小茴香精油屬于高度敏感的范疇，山蒼子精油在該實驗中能有效抑制霉菌生長，屬三種精油中最敏感的；丁香與小茴香精油對霉菌有較強的抑制作用，它們的抑制圈十分明顯，抑制圈呈橢圓形，輪廓線表現(xiàn)不規(guī)則狀。其它精油雖然也對飼料霉菌有一定的抑制作用，但是相比之下不太明顯。

表1 6 種植物精油對飼料霉菌的抑制效果

3.2 復方精油對飼料霉菌的抑制作用

由3.1 測定結(jié)果可知，山蒼子精油是最具有抑制霉菌的單方精油，其次是小茴香精油和丁香精油，為了更深入地了解它們聯(lián)合效果，將山蒼子精油和其它兩種精油等體積復合，分別測定它們對霉菌的抑菌圈直徑，其結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，山蒼子、山蒼子+ 小茴香（1∶1）和山蒼子+丁香+ 小茴香（1∶1∶1）組的抑菌圈均大于90 mm。因此，山蒼子單方精油及山蒼子+ 小茴香和山蒼子+ 丁香+ 小茴香的復合精油均有較好的抑制飼料霉菌效果。

表2 復方植物精油對飼料霉菌的抑制效果

為了科學評價山蒼子精油、小茴香精油和丁香精油單方精油及其復合精油對霉菌的抑制效果，分別進行了最低抑菌濃度（MIC） 的測定和聯(lián)合抑菌評價（FIC）實驗。由表2 可知，小茴香+ 山蒼子精油（1∶1 混合）的MIC 比復合小茴香+ 山蒼子和丁香精油（1∶1∶1 混合）低，說明復合小茴香+ 山蒼子精油的抑菌效果比復合小茴香+ 山蒼子+ 丁香精油的抑菌效果好。此外，復合小茴香+ 山蒼子精油的FIC 為0.926<1，說明復合精油中的小茴香精油和山蒼子精油的抑菌效果是相加作用。而復合小茴香+ 山蒼子+ 丁香中的1

3.3 不同比例復合小茴香和山蒼子精油對飼料霉菌的抑制作用

由以上試驗結(jié)果可知，在多種復合精油中，小茴香精油和山蒼子精油復合的抑菌效果最佳。但不同的精油配比對抑菌效果則不同，因此，為了更進一步確定最佳復合精油配比，對小茴香精油和山蒼子精油以（7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7）比例混合，每組三個平行實驗，用無菌水作為對照，進行了10天抑菌效果的實驗，得出實驗結(jié)果見表3。由表3 可知，各種不同配比濃度的復合小茴香+ 山蒼子精油對飼料霉菌均有抑制作用，且以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7（小茴香精油：山蒼子精油）混合精油的抑菌能力相對較好，而1∶5（小茴香精油：山蒼子精油）的MIC 值最低。因此，最好的復合精油混合比例是小茴香精油：山蒼子精油=1∶5。

表3 復合小茴香和山蒼子對飼料霉菌的抑制作用

4 討論

飼料在加工、儲存和運輸過程中容易發(fā)生霉變，霉變后產(chǎn)生的霉菌毒素不僅污染飼料、降低營養(yǎng)價值，還會引起畜禽產(chǎn)生一系列的健康問題，如中毒、腹瀉、生長和繁殖障礙等癥狀，嚴重影響動物的生產(chǎn)（Rocha 等，2014）。王曉佳的調(diào)查研究證實，75%～100%的飼料樣本含有一種以上的霉菌毒素，在低劑量的情況下就可能影響動物健康。大多數(shù)霉菌能夠同時產(chǎn)生多種霉菌毒素，飼料可能同時被幾種霉菌毒素污染，進而引起畜牧產(chǎn)品質(zhì)量下降和飼料工業(yè)的混亂，甚至可能導致高污染作物的拒收和處理（王曉佳，2021）。由于植物精油具有無毒、較強的抑菌性和環(huán)境友好等優(yōu)點，本文主要對山蒼子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角植物精油的抑菌特性進行了研究，并證實其對飼料霉菌具有一定的抑制效果。

抑菌圈的大小反映了精油對霉菌的抑制效果，抑菌圈直徑越大，精油抑制霉菌效果越好。最低抑制濃度是能抑制培養(yǎng)基內(nèi)霉菌生長的最低精油濃度，是測量抗菌藥物的抗菌活性大小的一個指標；而聯(lián)合抑菌評價是通過評價復合精油的各種成分相互作用的效果。植物精油在抑制霉菌生長及毒素產(chǎn)生方面效果理想，是潛在飼料防霉劑（梁丹丹等，2015；尚繼峰等，2007；王利 敏 等，2018； 代 安 娜 等，2021）。中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所質(zhì)量與安全研究室比較了山蒼子油、丁香酚、肉桂醛、檸檬醛、桉葉油、茴香油、樟腦油和薄荷油等8 種植物精油對黃曲霉、鐮刀菌、赭曲霉等生長和產(chǎn)毒的抑制效果，發(fā)現(xiàn)肉桂醛和丁香酚可有效抑制黃曲霉的生長及產(chǎn)毒。另有研究證實，黃曲霉、灰綠曲霉及青霉對丁香精油屬于高度敏感（梁丹丹等，2015）。此外復合植物精油防霉劑（肉桂醛∶檸檬醛∶丁香酚∶薄荷醇=3∶3∶2∶2，v/v/v/v）應用在玉米儲藏上，可有效抑制黃曲霉生長（尚繼峰等，2007）。采用濾紙片法測定丁香、八角、薄荷、花椒、大蒜、橙皮及復合精油對從玉米中分離得到的黃曲霉、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、青霉菌和雜色曲霉的抑制作用，證實丁香∶八角∶薄荷∶花椒=1∶1∶1∶1復合精油對上述霉菌均有抑制作用，對青霉菌的抑制作用最為顯著。且復合精油均高于霉菌對相同劑量的單種精油的敏感度（王利敏等，2018）。由于精油經(jīng)過一定體積比的復合后可以起到協(xié)同增效的作用，而得到比單種精油更好地抑菌效果（代安娜等，2021）。本研究通過抑菌圈、最低抑制濃度的測定，聯(lián)合抑菌評價，在6 種植物精油中篩選出對霉菌有較好抑制作用的山蒼子植物精油。并發(fā)現(xiàn)復合精油的抑菌效果比單方精油的抑菌效果好，小茴香精油和山蒼子精油以1:5 比例混合時對飼料霉菌具有最佳抑制效果。因此，該復合精油可用作天然飼料防霉劑。