• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    聚γ-谷氨酸分子結(jié)構(gòu)變化在氯化鉀降低發(fā)酵液黏度中的作用

    2021-12-03 09:25:30李凌甫陳桂光梁智群
    食品科學(xué) 2021年22期
    關(guān)鍵詞:構(gòu)象水溶液谷氨酸

    李凌甫,蔣 莉,劉 瑤,丁 蘇,陳桂光,梁智群,曾 偉

    (廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室,廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心,廣西 南寧 530004)

    聚γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,PGA)是一種由D-谷氨酸和(或)L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵鏈接而成的陰離子型高分子聚合物[1]。PGA特殊的聚酰胺結(jié)構(gòu)和主鏈上大量的游離羧基賦予其獨特的生化特性,如水溶性、可降解性、無毒、無免疫原性及羧基可作為活性位點進行修飾等性質(zhì)[2]。因此,PGA及其衍生物被廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。在食品領(lǐng)域,PGA可以作為冷凍保護劑、增稠劑、祛苦劑等[4]。例如,白登榮等[5]利用PGA改善雞肉糜凝膠的性質(zhì);李天密等[6]利用PGA改善殼聚糖/姜黃素可食性復(fù)合膜的厚度和水溶性。

    PGA生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法,其中化學(xué)合成法存在合成路線長、副產(chǎn)物多、收率低、產(chǎn)物分子質(zhì)量低等問題,而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)過程易控、周期短、產(chǎn)率高、產(chǎn)量穩(wěn)定、后處理工藝簡單、便于大規(guī)模生產(chǎn),因此PGA生產(chǎn)主要利用微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵生產(chǎn)PGA的主要菌株為谷氨酸依賴型的芽孢桿菌屬細菌,采用合成培養(yǎng)基,其中碳氮源和谷氨酸是必需組分,起始pH值一般維持在6.5~7.5之間,溫度30~40 ℃,發(fā)酵周期36~96 h,PGA產(chǎn)量與適宜的碳氮比、底物添加量和無機鹽密切相關(guān)[7]。采用補料分批發(fā)酵工藝,PGA發(fā)酵產(chǎn)量較高的可達30~50 g/L[8]。但在發(fā)酵過程中由于PGA的高分子和聚電解質(zhì)特性會引起發(fā)酵液黏度增大,尤其是在發(fā)酵后期,底物、溶氧和熱量的傳遞受到嚴(yán)重限制,從而制約了PGA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率的進一步提高[1]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)KCl對PGA發(fā)酵液黏度具有顯著調(diào)節(jié)作用,當(dāng)添加15 g/L KCl至培養(yǎng)基時,盡管菌體生長受到一定抑制,但發(fā)酵液黏度顯著降低了82.6%,PGA產(chǎn)量提高了39.5%[9]。

    PGA分子結(jié)構(gòu)(分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象)與其水溶液的黏度極具相關(guān)性,且隨環(huán)境因素如溫度、溶液pH值、離子強度、PGA質(zhì)量濃度等變化而變化,表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性[10]。推測PGA分子結(jié)構(gòu)的變化在KCl降低PGA發(fā)酵液黏度的過程中可能起重要作用。因此,KCl對PGA分子結(jié)構(gòu)的影響值得深入探究。本實驗利用1 株谷氨酸依賴型菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)GXA-28為研究對象,通過在其發(fā)酵培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl研究該菌株合成的PGA分子結(jié)構(gòu)變化情況及其對發(fā)酵液黏度的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    實驗所用菌株為本實驗室自主篩選的B.subtilisGXA-28,菌株保藏編號CCTCC M 2012347。

    葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl 天津博迪化工有限公司;酵母膏 京奧博星生物技術(shù)有限公司;谷氨酸鈉 廣西南寧荷花味精有限公司;聚環(huán)氧乙烷日本TOSOH公司;無水乙醇 西隴化工有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)(配有示差檢測器和二極管陣列檢測器) 日本Shimadzu公司;NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;STA449F3同步熱分析儀 德國Netzsch公司;MOS-450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司;LSI-3DLS激光光散射儀 瑞士Lsinstruments公司;冷凍干燥儀 美國Labconco公司;R/S-CC旋轉(zhuǎn)流變儀 德國Brookfield公司。

    1.3 方法

    1.3.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

    1.3.1.1 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,酵母膏5 g/L,谷氨酸鈉5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,pH 7.2±0.1;115 ℃滅菌30 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母膏2.5 g/L,谷氨酸鈉20 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,pH 7.2±0.1;115 ℃滅菌30 min。對照組發(fā)酵培養(yǎng)基不添加KCl,實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基加入15 g/L KCl。

    1.3.1.2 培養(yǎng)方法

    種子培養(yǎng):吸取1.5 mL保藏于-20 ℃的甘油菌種,接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,200 r/min、45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h。

    發(fā)酵培養(yǎng):按2%(V/V)接種量將種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,200 r/min、45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

    1.3.2 PGA純化

    發(fā)酵液經(jīng)去離子水稀釋5 倍后,4 ℃、13 400×g離心20 min除去菌體,上清液與4 倍體積無水乙醇混合,9 000×g離心5 min收集沉淀,真空干燥;再加入適當(dāng)體積去離子水復(fù)溶,13 400×g離心10 min除去不溶物;用截留分子質(zhì)量10 kDa的透析袋,4 ℃過夜透析,真空冷凍干燥即得純化樣品,純化樣品溶于去離子水中pH值為7.0[11]。

    1.3.3 分子質(zhì)量分析

    取PGA純化樣品(10 mg,干質(zhì)量)溶于10 mL去離子水中,4 ℃、13 400×g離心10 min去除不溶物,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。采用LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)分析PGA分子質(zhì)量:色譜柱為TSK-GELG6000PWXLColumn(7.8 mm×300 mm,5 μm),流動相為去離子水,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量20 μL,示差檢測器。用聚環(huán)氧乙烷作分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

    1.3.4D/L-谷氨酸比例分析

    取PGA純化樣品(500 mg,干質(zhì)量)于水解管中,加入10 mL 6 mol/L HCl溶液,抽真空,105 ℃酸解8 h。冷卻后,用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0,定容至100 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。采用LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)分析PGA的D/L-谷氨酸組成:色譜柱為CHIRALPAK MA(+),流動相為2 mmol/L CuSO4溶液,流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃,進樣量10 μL,二極管陣列檢測器[13]。

    1.3.5 靜態(tài)光散射分析

    將PGA純化樣品溶解于經(jīng)0.22 μm膜過濾的去離子水中,PGA質(zhì)量濃度范圍為1~10-6g/L,靜置6 h備用。使用LSI-3DLS激光光散射儀進行靜態(tài)光散射分析。該儀器裝備22 mW He-Ne激光光源,測試波長632.8 nm,測試角度范圍30°~120°,間隔為15°,每個角度重復(fù)測量4 次,測試溫度25 ℃。重均分子質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)半徑和第二維利系數(shù)由Zimm plot軟件計算得到[14]。

    1.3.6 圓二色譜分析

    采用圓二色譜通過監(jiān)測酰胺鍵發(fā)生電子躍遷的紫外區(qū)域(180~250 nm)進行二級結(jié)構(gòu)分析。取PGA純化樣品溶解于去離子水中作為待測樣品,PGA質(zhì)量濃度為1 g/L,0.22 μm膜過濾,pH 7.0。使用MOS-450圓二色譜儀進行分析,掃描范圍190~250 nm,石英比色皿寬1 mm,溫度45 ℃。圓二色譜圖用去卷積軟件CDNN2.1進行二級結(jié)構(gòu)分析[15]。

    1.3.7 紅外光譜分析

    紅外光譜分析PGA分子構(gòu)象。取PGA純化樣品與干燥KBr粉末(質(zhì)量比1∶100)混合后,研磨壓片,利用NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)掃描分析PGA,掃描次數(shù)32 次[16]。

    1.3.8 差示掃描量熱和熱重分析

    PGA的熔點和熱降解溫度由STA449F3同步熱分析儀分析。PGA純化樣品放置于氧化鋁坩堝上,升溫速率10 ℃/min,溫度范圍25~800 ℃,氮氣速率20 mL/min。熔點選取吸熱峰峰值[14]。

    1.3.9 PGA溶液剪切黏度分析

    將PGA純化樣品完全溶解于去離子水中,PGA質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL,測定溫度為25 ℃,利用R/S-CC旋轉(zhuǎn)流變儀測定靜置0 h和6 h后的PGA水溶液的剪切黏度,剪切速率范圍為3~35 s-1[16]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PGA分子質(zhì)量分析

    如表1所示,當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L時,B.subtilisGXA-28合成PGA的重均分子質(zhì)量和數(shù)均分子質(zhì)量均有所降低,其中重均分子質(zhì)量從(3 590±10)kDa下降至(3 090±10)kDa,數(shù)均分子質(zhì)量從(1 620±26)kDa下降至(1 210±40)kDa,但多聚分散性從2.22提高至2.55。多聚分散性的提高是因為在添加15 g/L KCl培養(yǎng)基中小分子質(zhì)量的PGA數(shù)量增加。在培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)調(diào)控PGA分子質(zhì)量的現(xiàn)象在其他菌株中也有類似報道,當(dāng)培養(yǎng)基中FeCl3質(zhì)量濃度從0 g/L增加至1.2 g/L時,Bacillus licheniformisATCC 9945a合成的PGA分子質(zhì)量從(1 310±140)kDa下降至(318±30)kDa[17]。PGA分子質(zhì)量對其黏度有重要作用,分子質(zhì)量越大則黏度越高[13,18-19]。但是,在本實驗中PGA分子質(zhì)量僅下降13.9%,在PGA產(chǎn)量提高39.5%的情況下,發(fā)酵液黏度卻降低了82.6%,說明PGA分子質(zhì)量降低只是引起發(fā)酵液黏度下降的一個原因。

    表1 KCl對PGA分子質(zhì)量的影響Table 1 Effect of KCl on the molecular mass of PGA

    2.2 PGA分子中D/L-谷氨酸比例分析

    如表2所示,當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L,PGA分子中D-谷氨酸比例從(47.66±0.10)%提高至(53.77±0.02)%,L-谷氨酸比例從(52.34±0.10)%下降至(46.23±0.03)%。除了K+之外,Mn2+已經(jīng)在B.subtilisNX-2、B.licheniformisATCC 9945a、B.licheniformisWBL-3等多株細菌中被證明能夠有效地改變PGA中D/L-谷氨酸的比例[20-22]。PGA分子中D/L-谷氨酸比例會影響其性質(zhì)[23]。例如,PGA分子中只含有D-谷氨酸或L-谷氨酸時可溶于乙醇,但當(dāng)含有相同含量D-谷氨酸和L-谷氨酸時則不溶于乙醇[24]。此外,PGA分子中D/L-谷氨酸比例還會導(dǎo)致其在構(gòu)象上存在差異[10]。所以,D-谷氨酸比例的提高會引起PGA性質(zhì)和構(gòu)象的變化,而這些變化可能與PGA溶液黏度有關(guān),但仍需進一步驗證。

    表2 KCl對PGA分子中D/L-谷氨酸比例的影響Table 2 Effect of KCl on the D/L-glutamate ratio of PGA

    2.3 靜態(tài)光散射分析

    如表3所示,經(jīng)過6 h靜置后,不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA重均分子質(zhì)量差別顯著,并且遠大于2.1節(jié)中分子質(zhì)量。當(dāng)培養(yǎng)基中KCl質(zhì)量濃度從0 g/L增加至15 g/L時,在水溶液中的PGA重均分子質(zhì)量從1.40×104kDa提高至5.22×107kDa。這是由于PGA分子會通過分子間相互作用使分子鏈糾纏形成聚集態(tài)、超螺旋和超折疊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致分子質(zhì)量增加[16]。在相同PGA質(zhì)量濃度下,聚集態(tài)、超螺旋和超折疊結(jié)構(gòu)的PGA溶液黏度低于正常狀態(tài)下的PGA黏度[25]。大幅提高的分子質(zhì)量表明KCl的添加使B.subtilisGXA-28合成的PGA分子更容易形成聚集態(tài)[16]。這表明在培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl合成的PGA水溶液黏度會更低。

    表3 KCl對PGA在水溶液中分子質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)半徑和第二維利系數(shù)的影響Table 3 Effect of KCl on the molecular mass, gyration radius and second virial coefficient of PGA in aqueous solution

    不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA旋轉(zhuǎn)半徑也存在差別。未添加KCl時,PGA旋轉(zhuǎn)半徑為69.52 μm,而添加15 g/L KCl時PGA旋轉(zhuǎn)半徑增加至80.72 μm。旋轉(zhuǎn)半徑的增加遠小于分子質(zhì)量的增加,由此推測15 g/L KCl下合成的PGA在水溶液中可能形成了更加緊密的結(jié)構(gòu)。無論添加KCl與否,PGA第二維利系數(shù)均為正數(shù),說明B.subtilisGXA-28合成的PGA具有良好的水溶性。此外,添加15 g/L KCl合成的PGA的第二維利系數(shù)是未添加KCl的3 倍,這說明添加15 g/L KCl合成的PGA與水分子之間的分子作用更強。

    2.4 紅外光譜分析

    如圖1所示,不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA均在3 300~3 400 cm-1處有一個寬峰。未添加KCl時寬峰較為尖銳且特征峰的波數(shù)為3 374 cm-1;添加15 g/L KCl時特征峰峰形平緩寬大,特征峰波數(shù)3 314~3 374 cm-1。上述寬峰是由酰胺鍵中—NH基團振動伸縮引起的,寬峰中波數(shù)大(一般大于3 350 cm-1)的特征峰是非氫鍵酰胺—NH基團引起的,而波數(shù)?。ㄒ话阈∮? 350 cm-1)的峰則是氫鍵酰胺—NH基團,當(dāng)兩種—NH基團共存時特征峰會重疊而形成寬峰[26]。由此可知,培養(yǎng)基中未添加KCl時合成的PGA分子中以非氫鍵酰胺—NH基團為主;培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時,PGA分子內(nèi)同時存在非氫鍵酰胺—NH和氫鍵酰胺—NH基團。這表明KCl的添加使PGA分子內(nèi)氫鍵增強。PGA分子內(nèi)氫鍵的強弱決定了PGA的構(gòu)象,分子內(nèi)氫鍵較強時PGA構(gòu)象呈α-螺旋。因此,KCl的添加有可能使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化。

    圖1 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of PGA synthesized with different KCl concentrations

    不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA分子在1 592 cm-1和1 420 cm-1處均有很強的振動峰,這兩個峰是—COOH基團去質(zhì)子化后形成的—COO—引起的,1 592 cm-1處為不對稱拉伸峰,而1 420 cm-1為對稱拉伸峰。這與PGA分子在偏中性和堿性條件下在1 590 cm-1和1 410 cm-1處出現(xiàn)特征峰[27]基本一致。此外,KCl的添加使PGA分子在1 629 cm-1處的特征峰移動到了1 635 cm-1。1 630~1 650 cm-1處的特征峰通常用于分析二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等)的變化,1 635 cm-1處的特征峰表明PGA分子內(nèi)存在α-螺旋結(jié)構(gòu)[28]。特征峰的移動表明KCl的添加使PGA構(gòu)象中形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。綜上所述,紅外光譜表明KCl的添加會使PGA分子內(nèi)氫鍵增強,從而形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。

    2.5 圓二色譜分析

    如圖2所示,不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA分子均在212 nm存在負峰。在遠紫外區(qū)時,β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽會在212 nm處形成負峰[15]。212 nm處的負峰表明不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA都存在β-折疊結(jié)構(gòu),且未添加KCl時合成的PGA分子以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時合成的PGA在209 nm和215 nm處形成了負峰。遠紫外區(qū)時,α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽會在209 nm處形成負峰[25]。由此可知,KCl的添加使PGA分子從β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。此外,215 nm處的負峰可能是由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向其他結(jié)構(gòu)時形成的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)而引起。圓二色譜結(jié)果表明,KCl的添加使PGA分子從β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。圓二色譜分析結(jié)果與紅外光譜結(jié)果基本一致。

    圖2 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA圓二色譜圖Fig.2 CD spectra of PGA synthesized with different KCl concentrations

    2.6 差示掃描量熱和熱重分析

    如圖3所示,第1個吸熱峰是PGA純化樣品中的水蒸發(fā)吸熱峰,質(zhì)量占據(jù)了樣品質(zhì)量的20%;第2個吸熱峰是PGA分子的吸熱峰,而該吸熱峰分成了2 個階段,第1階段的吸熱峰面積較第2個階段大。當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L時,PGA熔點從376.46 ℃提高至377.26 ℃,焓變從486.6 J/g提高至498.1 J/g(表4)。這表明隨培養(yǎng)基中KCl添加量的增加,PGA熔點和焓變稍有提高。

    圖3 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA差示掃描量熱圖Fig.3 Differential scanning calorimetry curves of PGA synthesized with different KCl concentrations

    表4 KCl對PGA熱力學(xué)性質(zhì)的影響Table 4 Effect of KCl on thermodynamic properties of PGA

    培養(yǎng)基中添加0 g/L和15 g/L KCl合成的PGA質(zhì)量損失溫度分別從365 ℃和368.5 ℃開始,直到800 ℃仍然存在質(zhì)量損失現(xiàn)象(圖4)。從質(zhì)量損失溫度開始,PGA的質(zhì)量損失曲線分為3 個階段,第1階段是PGA在高溫(質(zhì)量損失開始溫度到410 ℃左右)下進行熱降解。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至410~500 ℃左右時,出現(xiàn)第2次質(zhì)量損失情況,即為第2階段的質(zhì)量損失。第3階段是PGA持續(xù)熱降解形成焦谷氨酸(500~800 ℃)。經(jīng)過質(zhì)量損失后,PGA殘余質(zhì)量在去除水分占比后大約為25%,這與其他文獻報道的PGA熱降解后殘余質(zhì)量基本一致,殘余物質(zhì)是PGA在高溫催化下形成的焦谷氨酸[29]。一般情況下,PGA的質(zhì)量損失過程不存在類似的第2階段質(zhì)量損失變化,但本研究中PGA質(zhì)量損失存在第2階段的質(zhì)量損失,這與其他報道結(jié)果存在差異[30]。差示掃描量熱分析與熱重分析結(jié)果表明KCl的添加使PGA熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度均略有提高。熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度會受到分子內(nèi)作用力的影響,分子內(nèi)作用力強時熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度會降低[14]。而PGA構(gòu)象由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了α-螺旋時,分子內(nèi)氫鍵增強,分子內(nèi)作用力減弱[27]。由此可知,KCl的添加使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化。

    圖4 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA熱重圖Fig.4 Thermogravimetry curves of PGA synthesized with different KCl concentrations

    2.7 PGA溶液剪切黏度分析

    如圖5所示,不同時間下,PGA水溶液均體現(xiàn)出剪切變稀的特性。剪切變稀的特性說明PGA水溶液屬于假塑性流體,其與其他報道一致[31]。不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA水溶液剪切黏度不同。當(dāng)培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時,PGA剪切黏度從2.12 Pa·s下降至1.44 Pa·s,剪切黏度降低了32.08%(圖5a)。此外,隨靜置時間的延長,PGA水溶液的剪切黏度明顯降低。PGA水溶液靜置6 h后,培養(yǎng)基中未添加KCl時合成的PGA水溶液剪切黏度為1.99 Pa·s,添加15 g/L KCl時的剪切黏度僅為1.14 Pa·s,相比于0 h的剪切黏度分別降低了6.14%和20.84%(圖5b)。這表明培養(yǎng)基中KCl的添加使PGA水溶液剪切黏度隨時間延長而降低的現(xiàn)象更明顯。該結(jié)果與2.3節(jié)推測基本一致。

    圖5 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA水溶液剪切黏度曲線Fig.5 Shear viscosity curves of PGA aqueous solutions synthesized with different KCl concentrations

    3 結(jié) 論

    利用凝膠滲透色譜、手性色譜、靜態(tài)光散射、圓二色譜、紅外色譜、熱分析以及剪切黏度測定等方法,對添加KCl培養(yǎng)基中B.subtilis合成的PGA分子結(jié)構(gòu)(分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象)進行了系統(tǒng)表征。當(dāng)培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時,PGA分子質(zhì)量下降13.9%,PGA分子中D-谷氨酸比例增加6.11%,PGA表現(xiàn)出更好的水溶性,且更易發(fā)生聚集而形成聚集態(tài),構(gòu)象上β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu),剪切黏度降低了32.08%(0 h)。

    PGA分子質(zhì)量和PGA分子中D-谷氨酸比例會受到PGA合成酶系的影響,其中PGA分子質(zhì)量主要受到PGA降解酶(如pgdS、ggt和cwlO等)的影響,PGA中D-谷氨酸比例則受到谷氨酸消旋酶或轉(zhuǎn)運酶(如glr和dat等)的影響[3,17]。KCl的添加有可能引起了上述酶系表達量的變化,使PGA分子質(zhì)量降低及PGA中D-谷氨酸比例提高。PGA分子質(zhì)量的降低和PGA中D-谷氨酸比例的提高降低了PGA溶液黏度。

    當(dāng)溶液pH值高于PGA等電點時,PGA分子在溶液中的帶負電荷,PGA分子之間排斥作用較強[7]。培養(yǎng)基中添加KCl時,部分K+會進入PGA分子中使PGA的負電荷降低,靜電排斥力減弱,因而容易聚集[16]。而PGA溶液黏度會隨聚集態(tài)程度的升高而降低,因此PGA易形成聚集態(tài)的特性會使PGA溶液黏度降低。

    此外,PGA構(gòu)象變化與KCl的添加密不可分。因為PGA構(gòu)象受到分子內(nèi)氫鍵的影響,H+會使PGA形成強烈的分子內(nèi)氫鍵,從而導(dǎo)致PGA構(gòu)象轉(zhuǎn)向α-螺旋[27]。K+與H+相似,K+的添加也會使PGA構(gòu)象向α-螺旋轉(zhuǎn)變,但K+直徑大于H+且K+的對于羧基的負電荷親和力弱于H+[32]。因此KCl的添加僅使PGA構(gòu)象由β-折疊轉(zhuǎn)向β-折疊和α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。PGA構(gòu)象對PGA溶液黏度意義重大,構(gòu)象為α-螺旋時PGA溶液黏度較低,β-折疊時黏度較高。因而,KCl的添加引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)變將會使PGA溶液黏度降低。

    綜上所述,KCl的添加會使PGA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,分子結(jié)構(gòu)的變化會直接導(dǎo)致PGA水溶液黏度降低,從而引起PGA發(fā)酵液黏度的降低。KCl降低發(fā)酵液黏度時分子結(jié)構(gòu)變化涉及分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象,而其他降低PGA發(fā)酵液黏度的方法引起的分子結(jié)構(gòu)變化往往是單方面的。如耐鹽B.subtilis(chungkookjang)發(fā)酵生產(chǎn)PGA時可以通過添加NaCl使發(fā)酵液黏度降低,NaCl的添加引起發(fā)酵液黏度降低的原因是NaCl導(dǎo)致PGA分子質(zhì)量的降低[13]。B.subtilisCGMCC 2108發(fā)酵生產(chǎn)PGA時,可以通過向培養(yǎng)基中添加CaCl2降低發(fā)酵液黏度,而導(dǎo)致發(fā)酵液黏度降低的原因是CaCl2使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化[31]。分子結(jié)構(gòu)多方面變化協(xié)同作用導(dǎo)致PGA發(fā)酵液黏度降低給開發(fā)降黏策略提供了新的思路和基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    構(gòu)象水溶液谷氨酸
    基于正交設(shè)計的谷氨酸發(fā)酵條件優(yōu)化
    N-月桂酰基谷氨酸鹽性能的pH依賴性
    問:如何鑒定谷氨酸能神經(jīng)元
    一種一枝黃花內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的計算研究
    DMAC水溶液乙酸吸附分離過程
    聚焦水溶液中的三大守恒關(guān)系
    TEA水溶液的流變性研究
    氧自由基和谷氨酸在致熱原性發(fā)熱機制中的作用與退熱展望
    玉米麩質(zhì)阿拉伯木聚糖在水溶液中的聚集和構(gòu)象
    添加酸對HPP-SO2水溶液熱解吸的影響
    久久久久久久久久久久大奶| www.av在线官网国产| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久 成人 亚洲| 免费在线观看日本一区| 亚洲成人手机| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 韩国精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本欧美视频一区| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人精品在线电影| 日韩视频在线欧美| 亚洲第一av免费看| 国产精品国产av在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品久久久av美女十八| 国产在线观看jvid| 青春草视频在线免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品国产av在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产精品1区2区在线观看. | 高清视频免费观看一区二区| 亚洲国产日韩一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产成人影院久久av| 一级,二级,三级黄色视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品国产一区二区久久| 免费在线观看黄色视频的| 日本一区二区免费在线视频| av福利片在线| 日韩制服骚丝袜av| 日韩中文字幕视频在线看片| www.精华液| 天堂8中文在线网| 99国产精品99久久久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 女人精品久久久久毛片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 夫妻午夜视频| www.精华液| 国产99久久九九免费精品| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲国产av新网站| 成人国语在线视频| 99热国产这里只有精品6| 国产精品 国内视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产免费av片在线观看野外av| 蜜桃在线观看..| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品.久久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 男女免费视频国产| 亚洲黑人精品在线| 精品福利永久在线观看| 国产精品 国内视频| 国产成人影院久久av| 成人手机av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人国语在线视频| 精品一区在线观看国产| 日日夜夜操网爽| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美精品亚洲一区二区| 在线 av 中文字幕| 99热全是精品| 热re99久久精品国产66热6| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品亚洲成a人片在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 一级片免费观看大全| cao死你这个sao货| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99热网站在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 两个人看的免费小视频| 国产成人免费无遮挡视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 精品久久久久久久毛片微露脸 | 最黄视频免费看| 多毛熟女@视频| 一二三四社区在线视频社区8| 精品一区在线观看国产| 午夜福利在线观看吧| 9热在线视频观看99| 亚洲一区二区三区欧美精品| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黄色视频,在线免费观看| 美女午夜性视频免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美黑人欧美精品刺激| 无限看片的www在线观看| av天堂久久9| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品九九99| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 黄片小视频在线播放| 99热全是精品| 久久青草综合色| 精品国产一区二区久久| 欧美xxⅹ黑人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 999久久久精品免费观看国产| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久国内视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲免费av在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 超色免费av| 欧美国产精品va在线观看不卡| www.999成人在线观看| 制服人妻中文乱码| 午夜福利乱码中文字幕| www.精华液| 少妇精品久久久久久久| 十分钟在线观看高清视频www| 国产在线一区二区三区精| 精品久久久久久电影网| 成人国产一区最新在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 国产精品av久久久久免费| 精品福利永久在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲人成电影观看| 欧美日韩一级在线毛片| 三级毛片av免费| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 人人妻人人澡人人看| 一进一出抽搐动态| 日本一区二区免费在线视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美xxⅹ黑人| 老鸭窝网址在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| av网站免费在线观看视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品 国内视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久女婷五月综合色啪小说| 精品国产乱码久久久久久小说| 黄片大片在线免费观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久99一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 秋霞在线观看毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜视频精品福利| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美黑人精品巨大| 蜜桃在线观看..| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜福利,免费看| 免费观看人在逋| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美精品亚洲一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产在视频线精品| 久久精品国产综合久久久| 久久 成人 亚洲| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品久久久av美女十八| 99热全是精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品在线美女| a级毛片黄视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日本一区二区免费在线视频| 热99re8久久精品国产| 国产国语露脸激情在线看| 99久久国产精品久久久| 99热网站在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产av新网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| e午夜精品久久久久久久| 首页视频小说图片口味搜索| 中文字幕色久视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲伊人色综图| 国产野战对白在线观看| 黄色 视频免费看| 成年人午夜在线观看视频| 18禁观看日本| 老汉色av国产亚洲站长工具| av福利片在线| 大片免费播放器 马上看| 乱人伦中国视频| 岛国毛片在线播放| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产欧美网| 精品人妻1区二区| 高清黄色对白视频在线免费看| 男女国产视频网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 十八禁人妻一区二区| svipshipincom国产片| 国产精品国产三级国产专区5o| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色视频在线播放观看不卡| 美女中出高潮动态图| 久久久久国内视频| 青春草视频在线免费观看| 国产在线视频一区二区| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看免费高清a一片| 久久久久久久国产电影| 老司机影院毛片| 亚洲国产av影院在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄色视频,在线免费观看| 成人国产av品久久久| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久久精品精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色怎么调成土黄色| 婷婷色av中文字幕| 久久久水蜜桃国产精品网| 少妇人妻久久综合中文| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲avbb在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 香蕉国产在线看| 看免费av毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一本久久精品| 欧美在线黄色| cao死你这个sao货| 国产精品一区二区在线不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 十分钟在线观看高清视频www| 不卡av一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇人妻久久综合中文| 日日夜夜操网爽| 久久久久久免费高清国产稀缺| 美女中出高潮动态图| 亚洲,欧美精品.| 免费观看av网站的网址| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜老司机福利片| 正在播放国产对白刺激| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产免费av片在线观看野外av| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 麻豆国产av国片精品| 美女高潮到喷水免费观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲人成电影免费在线| 国产片内射在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产精品99久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久久久久免费高清国产稀缺| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品亚洲成a人片在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产91精品成人一区二区三区 | 叶爱在线成人免费视频播放| 美女大奶头黄色视频| 99精品久久久久人妻精品| 欧美国产精品一级二级三级| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品人妻在线不人妻| 久久女婷五月综合色啪小说| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品自拍成人| 精品欧美一区二区三区在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 超碰97精品在线观看| 成年动漫av网址| 在线av久久热| 亚洲国产欧美网| 在线观看一区二区三区激情| 91成年电影在线观看| 久9热在线精品视频| 日韩制服骚丝袜av| 午夜福利视频精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久精品国产综合久久久| 91字幕亚洲| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| a在线观看视频网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品熟女久久久久浪| 十八禁高潮呻吟视频| 最近中文字幕2019免费版| 男女国产视频网站| 国产精品影院久久| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久视频综合| 欧美激情久久久久久爽电影 | 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美97在线视频| 国产福利在线免费观看视频| 桃花免费在线播放| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产野战对白在线观看| 69av精品久久久久久 | 桃红色精品国产亚洲av| 色视频在线一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费在线观看完整版高清| 美女主播在线视频| 亚洲成人手机| 国产深夜福利视频在线观看| av有码第一页| 国产一区二区在线观看av| 亚洲专区字幕在线| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲人成77777在线视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲中文日韩欧美视频| av线在线观看网站| 久久国产精品大桥未久av| 成人国产av品久久久| 国产激情久久老熟女| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一卡二卡三卡精品| 蜜桃国产av成人99| 午夜福利,免费看| 久久香蕉激情| 亚洲欧美一区二区三区久久| 丁香六月天网| 黄片大片在线免费观看| xxxhd国产人妻xxx| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩欧美免费精品| 免费av中文字幕在线| 另类精品久久| 美女高潮到喷水免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 一级a爱视频在线免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 三上悠亚av全集在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品第二区| 亚洲精品一二三| 免费人妻精品一区二区三区视频| 丰满少妇做爰视频| 久久久精品免费免费高清| 99热国产这里只有精品6| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av天堂在线播放| 国产福利在线免费观看视频| 国产人伦9x9x在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91成年电影在线观看| 国产男女内射视频| 999久久久精品免费观看国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看免费视频网站a站| 一级片免费观看大全| 欧美少妇被猛烈插入视频| 激情视频va一区二区三区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 大陆偷拍与自拍| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精品国产av成人精品| 无遮挡黄片免费观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久精品国产a三级三级三级| 人成视频在线观看免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 日本五十路高清| 亚洲七黄色美女视频| av天堂久久9| 好男人电影高清在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇的丰满在线观看| 午夜免费鲁丝| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产主播在线观看一区二区| 国产成人影院久久av| 国产av国产精品国产| 欧美在线黄色| tocl精华| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美午夜高清在线| 精品久久久久久电影网| 精品福利观看| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品免费大片| 欧美 日韩 精品 国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av国产精品久久久久影院| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲美女黄色视频免费看| netflix在线观看网站| 国产一卡二卡三卡精品| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美精品亚洲一区二区| 90打野战视频偷拍视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品久久二区二区91| 久久久久久久精品精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久9热在线精品视频| 手机成人av网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲国产成人精品v| 十分钟在线观看高清视频www| 激情视频va一区二区三区| 久久99一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 精品人妻在线不人妻| 国产成人av教育| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜福利在线免费观看网站| av一本久久久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲熟女精品中文字幕| www日本在线高清视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久久精品精品| 亚洲视频免费观看视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 不卡一级毛片| 免费高清在线观看视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲人成77777在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜影院在线不卡| 国产av又大| a级毛片黄视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲综合色网址| 老司机靠b影院| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜福利视频精品| 久久久欧美国产精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 9热在线视频观看99| 99精国产麻豆久久婷婷| 91大片在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲美女黄色视频免费看| av不卡在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 夫妻午夜视频| 国产又爽黄色视频| 99热网站在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 在线看a的网站| 亚洲成人手机| 一二三四社区在线视频社区8| 久久ye,这里只有精品| 成年动漫av网址| 中文字幕色久视频| 免费黄频网站在线观看国产| 午夜老司机福利片| 另类精品久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 看免费av毛片| 日韩欧美一区视频在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费看十八禁软件| 色老头精品视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 午夜福利视频精品| 久久av网站| 男女国产视频网站| av在线老鸭窝| 欧美日韩一级在线毛片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品 国内视频| 国产亚洲精品一区二区www | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 婷婷成人精品国产| 久久久国产精品麻豆| 99热网站在线观看| 成人免费观看视频高清| 多毛熟女@视频| 国产真人三级小视频在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲人成77777在线视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 国产高清videossex| av在线老鸭窝| 在线av久久热| 十八禁高潮呻吟视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久久久久国产电影| 十八禁人妻一区二区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品偷伦视频观看了| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 高潮久久久久久久久久久不卡| 1024香蕉在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 飞空精品影院首页| 国产免费福利视频在线观看| 咕卡用的链子| www.av在线官网国产| 免费在线观看日本一区| 亚洲久久久国产精品| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲国产精品999| 精品一区二区三区av网在线观看 | 老司机亚洲免费影院| 亚洲欧美精品自产自拍| 我要看黄色一级片免费的| 色94色欧美一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丰满少妇做爰视频| 大陆偷拍与自拍| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 午夜91福利影院| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产精品久久久久久精品古装| 十八禁人妻一区二区| 超碰97精品在线观看| 香蕉国产在线看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久国产精品影院| 视频在线观看一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利在线观看吧| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产黄色免费在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 午夜福利视频精品| 色94色欧美一区二区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 免费观看av网站的网址| 水蜜桃什么品种好| a在线观看视频网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人国语在线视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 丁香六月欧美| 精品免费久久久久久久清纯 | 丁香六月天网| 国产精品一区二区在线不卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 久久热在线av| 五月开心婷婷网| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲av国产av综合av卡|