對(duì)羥基苯甲醛和阿魏酸對(duì)釀酒酵母理化特性的影響

安佳星，龍秀鋒，伍時(shí)華，曾令杰，黃錦翔，豐丕雪，易 弋

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

由于化石能源在使用過程中引起的環(huán)境問題，使綠色生物能源越來越受到人們的關(guān)注。燃料乙醇作為一種重要的清潔可再生能源，以其循環(huán)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已迅速發(fā)展成為全球可再生能源領(lǐng)域的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)[1]。但國內(nèi)大部分地區(qū)主要以玉米、甘蔗等糧食作物為原料生產(chǎn)燃料乙醇[2]，而這些作物的供應(yīng)有限，會(huì)導(dǎo)致燃料乙醇生產(chǎn)與糧食供應(yīng)之間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。木質(zhì)纖維素[3]主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，是世界上儲(chǔ)量最豐富的碳水化合物資源，若將木質(zhì)纖維素用于生產(chǎn)燃料乙醇，將更有利于節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展[4]。在以木質(zhì)纖維素為原料的燃料乙醇生產(chǎn)過程中，經(jīng)預(yù)處理和水解盡管提高了木質(zhì)素的降解率[5-6]，增加了纖維素和半纖維素的含量，但也產(chǎn)生了大量的抑制物，如弱酸類、呋喃類、酚類化合物，這些物質(zhì)的存在會(huì)對(duì)酵母生長造成一定影響[7]。

對(duì)羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde，pb）和阿魏酸（ferulic acid，fer）是木質(zhì)纖維素水解液中的主要酚類化合物，其毒性作用強(qiáng)于水解液中的其他酚類抑制物。為探明這兩種抑制物對(duì)釀酒酵母的毒性，通過測(cè)定pb和fer處理后釀酒酵母的生長情況、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜通透性、海藻糖含量、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析等，初步了解抑制物對(duì)釀酒酵母的破壞程度，以期為揭示pb和fer對(duì)釀酒酵母的毒性機(jī)理以及培育耐受性菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GGSF16由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所提供；pb、fer、醋酸鋇、間苯二酚、硫脲 上海麥克林生化科技有限公司；D-海藻糖、蒽酮 北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸西隴科學(xué)股份有限公司；戊二醛 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；所有溶劑均為國產(chǎn)分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha1-2LDplus真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；456-GC氣相色譜儀 天美創(chuàng)科儀器（北京）有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 濟(jì)南延和生物科技有限公司；Phenom飛納臺(tái)式掃描電鏡 復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；PerkinElmer FTIR儀（Frontier）興和儀器（上海）有限公司；UV-8000S紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；H2100R低溫高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；ZWYRC2402C疊式恒溫調(diào)速搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌菌懸液制備

從YPD平板上挑取釀酒酵母GGSF16單菌落到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)活化，調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL，備用。

1.3.2 pb和fer對(duì)細(xì)胞生長的影響

按10%接種量，將酵母菌菌懸液接種到200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在無菌操作下將pb和fer加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別制成0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 g/L質(zhì)量濃度梯度，以未添加pb和fer的菌液為對(duì)照組，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，測(cè)定樣品在600 nm波長處OD值，每隔2 h測(cè)一次，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.3 pb和fer對(duì)糖代謝和乙醇發(fā)酵的影響

按照1.3.2節(jié)方法，將pb和fer分別制成1.0 g/L和1.25 g/L質(zhì)量濃度，以未添加pb和fer的菌液為對(duì)照組，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取上清液，適當(dāng)稀釋，用生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵過程中葡萄糖質(zhì)量濃度，用氣相色譜儀測(cè)定發(fā)酵過程中乙醇質(zhì)量濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 pb和fer對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響

按10%接種量，將酵母菌菌懸液接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，將100 mL菌液（菌液濃度107CFU/mL）加入含有pb和fer的100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，使pb和fer的終質(zhì)量濃度分別為1.0 g/L和1.25 g/L。30 ℃、160 r/min培養(yǎng)4 h，5 000 r/min離心10 min，參考Dai Chunhua等[8]方法，分別在260 nm和280 nm波長處測(cè)定上清液OD值，表示核酸和蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 pb和fer對(duì)胞內(nèi)海藻糖含量的影響

1.3.5.1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制0.1 mg/mL的海藻糖母液，稀釋成0.01～0.09 mg/mL海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液，以水為空白對(duì)照。每個(gè)樣品取1 mL于具塞比色管中，加入5 mL硫酸-蒽酮試劑，混勻后沸水浴10 min，立即放入冰水浴中冷卻，測(cè)定樣品的OD620nm。

1.3.5.2 胞內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定

按照1.3.4節(jié)方法，取兩份培養(yǎng)液各5 mL，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用水洗滌3 次，其中一份烘干稱質(zhì)量，另一份加入4 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液重懸菌體，冰浴1.5 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻，萃取結(jié)束后10 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，加入5 mL硫酸-蒽酮試劑，混勻后置于沸水浴10 min，立即放入冰水浴中冷卻，測(cè)定OD620nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 分子結(jié)構(gòu)的FTIR分析

采用FTIR法[9]對(duì)酵母分子結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行分析，按照1.3.4節(jié)方法獲得培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3 次，真空冷凍干燥后用FTIR儀對(duì)干燥酵母細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

參考文獻(xiàn)[10-11]方法，觀察酵母菌在pb和fer脅迫下的細(xì)胞形態(tài)變化。按照1.3.4節(jié)方法獲得培養(yǎng)液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀細(xì)胞中加入2.5%戊二醛溶液1 mL，4 ℃過夜固定，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用20%～100%的乙醇溶液脫水處理，5 000 r/min離心10 min收集菌體，真空冷凍干燥后噴金，用掃描電子顯微鏡觀察酵母菌的形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin Pro 9.1軟件（單因素方差分析）和Graphpad Prism 8.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 pb和fer對(duì)細(xì)胞生長的影響

由圖1可以看出，對(duì)照組的酵母生長速率較高，在開始的8 h內(nèi)迅速生長，之后趨于穩(wěn)定，而從圖1A可以看出，隨著pb質(zhì)量濃度的增加，對(duì)釀酒酵母的抑制作用越來越明顯，當(dāng)pb質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)，釀酒酵母的生長被完全抑制，為保證后續(xù)的分析，選取pb質(zhì)量濃度為1.0 g/L。如圖1B所示，fer質(zhì)量濃度不高于1.5 g/L時(shí)，對(duì)數(shù)生長期延長[12-13]，在穩(wěn)定期的OD值比對(duì)照組低，但釀酒酵母的生長曲線沒有產(chǎn)生很明顯的分離現(xiàn)象，而當(dāng)fer質(zhì)量濃度高于1.75 g/L時(shí)，釀酒酵母的OD值突然降低，說明fer質(zhì)量濃度在1.75 g/L以上時(shí)，酵母的生長會(huì)受到明顯的抑制，由圖1B也可以看出，fer質(zhì)量濃度在2.0 g/L時(shí)，釀酒酵母的生長被完全抑制，為保證后續(xù)的分析，選取fer質(zhì)量濃度為1.25 g/L。

圖1 pb（A）和fer（B）對(duì)釀酒酵母生長的影響Fig.1 Effects of p-hydroxybenzaldehyde (A) and ferulic acid (B) on the growth of S.cerevisiae

2.2 pb和fer對(duì)釀酒酵母糖代謝及乙醇含量的影響

釀酒酵母利用葡萄糖可以產(chǎn)生乙醇，而pb和fer的添加會(huì)抑制酵母菌的生長從而抑制葡萄糖的消耗及乙醇的生成。由圖2可知，對(duì)照組在6～10 h葡萄糖消耗較快，第12小時(shí)葡萄糖基本消耗完全，乙醇在6～10 h產(chǎn)量較多，并在第12小時(shí)趨于平緩。而在釀酒酵母中添加1.25 g/L fer后葡萄糖消耗延遲為6～12 h，14 h葡萄糖基本消耗完全，乙醇的快速生成延遲為6～12 h，之后乙醇生成緩慢增長，基本達(dá)到對(duì)照組的乙醇產(chǎn)量。當(dāng)在釀酒酵母中添加1.0 g/L pb后葡萄糖消耗延遲為6～16 h，16 h葡萄糖基本消耗完全，乙醇在6～16 h呈指數(shù)形式快速產(chǎn)生，并在第16小時(shí)基本達(dá)到對(duì)照組乙醇含量。因此，1.25 g/L的fer對(duì)細(xì)胞抑制作用略低于1.0 g/L的pb。

圖2 pb和fer脅迫下釀酒酵母葡萄糖含量及乙醇產(chǎn)量變化曲線Fig.2 Changes in glucose content and ethanol production of S.cerevisiae under p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid stress

2.3 pb和fer對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜通透性的影響

從表1可以看出，與對(duì)照組相比，pb處理后釀酒酵母的核酸和蛋白質(zhì)釋放量分別增加58.1%和37.6%，fer處理后釀酒酵母的核酸和蛋白質(zhì)釋放量分別增加47.7%和12.0%，通過比較發(fā)現(xiàn)，OD260nm比OD280nm增加更為明顯，可能是因?yàn)楹怂岬南鄬?duì)分子質(zhì)量比蛋白質(zhì)小，核酸比蛋白質(zhì)更容易透過細(xì)胞膜。

表1 胞外DNA和蛋白質(zhì)含量Table 1 Effect of p-hydroxybenzaldehyde and ferulic acid on extracellular DNA and protein contents of S.cerevisiae

2.4 pb和fer對(duì)胞內(nèi)海藻糖含量的影響

由圖3可以看出，與對(duì)照組相比，加入1.0 g/L pb和1.25 g/L fer在第0小時(shí)海藻糖含量沒有顯著變化；在第4小時(shí)海藻糖含量明顯增多，經(jīng)pb處理后比對(duì)照組的海藻糖含量高約34.4%，fer處理后比對(duì)照組的海藻糖含量高約16.9%，可能原因是經(jīng)pb和fer處理后，酵母細(xì)胞為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的壓力，從而產(chǎn)生大量的海藻糖[14]。通過對(duì)比pb和fer處理后細(xì)胞的海藻糖含量變化，發(fā)現(xiàn)pb處理后的海藻糖含量比fer處理后的海藻糖含量高約15.0%，可能原因是pb對(duì)酵母的生長抑制比例比fer大，因此，pb處理后比fer處理后的胞內(nèi)海藻糖含量多。

圖3 pb和fer對(duì)釀酒酵母海藻糖含量的影響Fig.3 Effects of p-hydroxybenzaldehyde and ferulic acid on intracellular trehalose content of S.cerevisiae

2.5 FTIR分析

根據(jù)前人的研究結(jié)果[15-17]，3 700 cm-1與3 000 cm-1之間有一較寬的吸收帶，是由于幾丁質(zhì)中的羥基和仲胺中的N—H的伸縮振動(dòng)引起；3 100～2 800 cm-1吸收峰為三?；视椭械闹舅狨；淐H2的拉伸，代表脂質(zhì)官能團(tuán)；表征蛋白質(zhì)最重要的譜帶是酰胺帶[18]，1 652、1 542、1 244 cm-1分別為酰胺I、II、III帶，其中1 652 cm-1吸收峰是C＝O的伸縮振動(dòng)引起的，1 542 cm-1吸收峰是N—H變形振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)的耦合振動(dòng)峰，1 244 cm-1吸收峰是由N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)引起，是蛋白質(zhì)的特征譜帶；1 078 cm-1左右的吸收峰為酵母中DNA、RNA、細(xì)胞壁中存在的碳水化合物或醇中的C—O伸縮振動(dòng)峰；915 cm-1左右的吸收峰代表細(xì)胞壁多糖環(huán)鍵。

由圖4可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)pb和fer處理后釀酒酵母的特征峰變化較明顯，特征峰吸光度整體呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)，在3 315 cm-1處吸收峰面積增加，表明pb和fer改變了細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞的身體骨架發(fā)生改變，不能正常保護(hù)細(xì)胞；代表脂質(zhì)的官能團(tuán)在3 002 cm-1和2 930 cm-1處的吸光度均明顯增強(qiáng)，表明pb和fer改變?；湣狢H2—的拉伸，從而對(duì)酵母細(xì)胞膜的脂質(zhì)產(chǎn)生破壞；在酰胺I帶峰的吸收強(qiáng)度有所增加，表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋或無規(guī)卷曲增加，酰胺II帶峰的吸收強(qiáng)度增加，表明蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的氫鍵締合作用加強(qiáng)，而蛋白質(zhì)是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的主要成分之一，因此，通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)而對(duì)酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生影響；在1 072 cm-1處的吸光度明顯增強(qiáng)，說明pb和fer改變了核酸的結(jié)構(gòu)；在914 cm-1處的吸收峰明顯增強(qiáng)，表明pb和fer改變了釀酒酵母表面的多糖羥基骨架，進(jìn)而改變酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。

圖4 pb和fer處理后FTIR圖Fig.4 FTIR before and after treatment with p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid

2.6 pb和fer對(duì)釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

空白對(duì)照組（圖5A）酵母細(xì)胞圓潤飽滿、形態(tài)完整、表面光滑，并且彼此間無粘黏，經(jīng)1.0 g/L pb處理組（圖5B）和1.25 g/L fer處理組（圖5C）作用后，酵母細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生了較大變化。經(jīng)pb處理后，細(xì)胞明顯變形，細(xì)胞壁嚴(yán)重脫落，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，增加細(xì)胞通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，細(xì)胞外有大量的黏膜，細(xì)胞粘黏在一起，阻礙酵母蛋白質(zhì)的正常表達(dá)，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成與酶的催化活性，進(jìn)而導(dǎo)致酵母正常生理功能喪失[19]，造成部分菌體死亡；經(jīng)fer處理后，細(xì)胞也明顯受到破壞，細(xì)胞表面褶皺變形，細(xì)胞壁塌陷，細(xì)胞呈黏連狀態(tài)。由結(jié)果可知，相對(duì)于fer處理組，pb處理后的釀酒酵母的形態(tài)有著更大的變化，在pb的作用下，釀酒酵母的細(xì)胞壁大量脫落，而失去細(xì)胞壁保護(hù)的酵母可能使更多的成分暴露于外膜（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)），細(xì)胞因不能正常生長而死亡。

圖5 pb和fer處理后掃描電子顯微鏡圖Fig.5 SEM images of S.cerevisiae before and after treatment with p-hydroxybenzaldehyde or ferulic acid

3 討 論

木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理會(huì)產(chǎn)生許多酚類抑制物，這些物質(zhì)的存在會(huì)抑制酵母細(xì)胞生長、底物利用、產(chǎn)物合成以及影響酵母細(xì)胞膜通透性，從而大大降低木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的生產(chǎn)效率。pb和fer作為木質(zhì)纖維素預(yù)處理水解液中毒性較強(qiáng)的酚類抑制物，添加到釀酒酵母中無疑會(huì)抑制細(xì)胞生長和乙醇的生成[20]。經(jīng)驗(yàn)證，1.0 g/L的pb和1.25 g/L的fer嚴(yán)重抑制酵母的生長，并且乙醇的發(fā)酵時(shí)間明顯延長。Yan Yu等[21]在香草醛存在下野生型梭狀芽孢桿菌BOH3出現(xiàn)自聚集，與對(duì)照組相比，在6.6 mmol/L香草醛的存在下，丁醇產(chǎn)量降低了（15.58±0.66）%。Xu Hongtao等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，0.5 g/L的香蘭素可以抑制67%的谷氨酸棒桿菌生長，而0.5 g/L的丁香醛可以完全抑制谷氨酸棒桿菌的生長。Pereira等[13]認(rèn)為，枯草芽孢桿菌不能在高于0.5 g/L的丁香醛環(huán)境下生長，在所選的抑制物中，香蘭素對(duì)酵母的抑制作用最大，在1.5 g/L時(shí)其生長速率降低了95%。

細(xì)胞膜作為生物與外界環(huán)境接觸的屏障，具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、確保物質(zhì)正常運(yùn)輸?shù)墓δ躘22]。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，胞內(nèi)的一些磷酸鹽、碳酸鹽、DNA、RNA等均會(huì)先后從細(xì)胞膜中釋放出來。經(jīng)pb和fer處理后，釀酒酵母的核酸和蛋白質(zhì)釋放量均顯著增加（P＜0.05），且pb處理組的釋放量比fer大，可能是由于pb對(duì)酵母的生長抑制作用比fer大造成。這與周倩倩等[23]研究丁香酚使腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌紫外吸收物質(zhì)泄漏的結(jié)論相似。海藻糖是已被認(rèn)為的抵抗多種不利環(huán)境變換的一種保護(hù)性細(xì)胞內(nèi)代謝物，為研究酵母細(xì)胞對(duì)代謝水平的應(yīng)激反應(yīng)，確定海藻糖含量的變化是必要的[24-25]。Guo Zhongpeng等[26]研究表明，暴露于弱酸環(huán)境下的酵母細(xì)胞中海藻糖含量會(huì)顯著提高。本研究結(jié)果表明，經(jīng)pb和fer處理后釀酒酵母的海藻糖含量均顯著增加（P＜0.05）。

FTIR可以反映pb和fer加入后釀酒酵母的分子組成變化[27]。Sayqal等[28]認(rèn)為甲苯脅迫對(duì)惡臭假單胞菌的最顯著影響與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分變化有關(guān)。本研究結(jié)果表明，經(jīng)pb和fer處理后釀酒酵母代表脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等分子成分官能團(tuán)發(fā)生變化，結(jié)合掃描電子顯微鏡，可以直觀看出經(jīng)pb和fer處理后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化，并且本研究結(jié)果與Jeyanthi等[29]報(bào)道的通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡分析確定甲氧西林誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)變化相似。

4 結(jié) 論

根據(jù)添加不同質(zhì)量濃度pb和fer的釀酒酵母生長曲線可知，1.0 g/L pb和1.25 g/L fer能明顯抑制釀酒酵母的生長。經(jīng)1.0 g/L pb和1.25 g/L fer處理均能使釀酒酵母糖代謝和乙醇發(fā)酵時(shí)間延長，且pb處理組的延長時(shí)間較fer處理組延長時(shí)間更長。pb和fer處理后會(huì)破壞酵母細(xì)胞膜，使核酸、蛋白質(zhì)泄漏到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)而死亡，為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化對(duì)酵母細(xì)胞造成影響，處理后的胞內(nèi)海藻糖含量均明顯提高。從pb和fer處理前后的掃描電子顯微鏡圖像可以看出，原本光滑完整的細(xì)胞出現(xiàn)褶皺、粘黏現(xiàn)象，并伴有細(xì)胞壁的脫落，結(jié)合FTIR呈現(xiàn)的代表脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等分子成分基團(tuán)的變化，進(jìn)一步說明了pb和fer對(duì)釀酒酵母的毒性，為揭示pb和fer對(duì)釀酒酵母的毒性機(jī)理以及培育耐受性菌株提供依據(jù)。