王靖雯,趙謀明,陳 濤,張佳匯,陳子杰,馮云子,*
(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510641;2.上海太太樂食品有限公司,上海 201206)
醬油是一種起源于中國的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品,因其獨特的風(fēng)味受到了全世界人民的喜愛[1]。醬油發(fā)酵包含兩個步驟,即制曲和醬醪發(fā)酵。制曲階段以米曲霉的生長和作用為主,隨著醬醪發(fā)酵階段的推進,米曲霉的作用減弱,耐鹽酵母菌和乳酸菌不斷增殖,代謝形成豐富的物質(zhì),包括氨基酸類、糖類、糖醇類、有機酸類、醇類和酯類等揮發(fā)性化合物,對提高醬油的風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻[2-4]。其中,耐鹽酵母菌對醬油揮發(fā)性物質(zhì)的積累具有重要作用[5]。
隨著風(fēng)味感官組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展以及醬油香氣活性物質(zhì)的鑒定,許多研究逐漸轉(zhuǎn)向酵母對醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。其中報道次數(shù)較多的有耐鹽生香酵母包括魯氏結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和易變假絲酵母(Candida versatilis)等。Yao Shangjie等[6]研究發(fā)現(xiàn)單獨接種魯氏結(jié)合酵母可以提升苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等醇類物質(zhì)的含量。Wah等[7]從醬油發(fā)酵1 個月的醬醪中分離得到嗜鹽的季也蒙畢赤酵母,發(fā)現(xiàn)其單獨接種發(fā)酵后的醬油中愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量明顯提升。張玲[8]研究新發(fā)現(xiàn)添加易變假絲酵母可以促進乙醇、乙酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚、甲基吡嗪、苯乙醛和4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮等風(fēng)味活性物質(zhì)含量的提升。除單菌種發(fā)酵對風(fēng)味影響的研究外,功能菌株混合培養(yǎng)的應(yīng)用逐漸成為熱點。Singracha等[9]發(fā)現(xiàn)魯氏結(jié)合酵母與季也蒙畢赤酵母共同接種發(fā)酵的醬油中乙醇、2-甲基-1-丙醇、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和3-羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮(麥芽酚)等物質(zhì)含量明顯高于單獨接種魯氏結(jié)合酵母發(fā)酵的醬油。通過總結(jié)國內(nèi)外文獻[10-12]中鑒定醬油酵母菌的種屬信息,共統(tǒng)計18 個菌屬,關(guān)于醬油酵母菌的相關(guān)研究有待深入,特別是一些含量較低的功能菌種有待挖掘。
因此,本研究擬從高鹽稀態(tài)醬油醬渣中篩選分離功能酵母菌,結(jié)合基因測序技術(shù)確定其種屬,選擇代表性菌株進行生理生化鑒定并探究其生長特性,將分離純化的酵母菌種單獨接種到醬油體系培養(yǎng),結(jié)合感官評價和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析判斷其風(fēng)味代謝特點,以期為醬油酵母資源的開發(fā)及發(fā)酵風(fēng)味調(diào)控提供理論指導(dǎo)。
高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵終點的醬渣樣品,取自廣東省某醬油廠。
氫氧化鈉、NaCl、鹽酸、葡萄糖、硫酸鎂、甲基紅指示劑、溴酚藍指示劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙醇、2-辛醇、2-甲基-3-庚酮(均為分析純) Sigma(上海)有限公司;PDA固體培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱有限公司。
氮源同化培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,(NH4)2SO4(其他氮源)5.0 g,KH2PO40.85 g,K2HPO40.15 g,MgSO40.50 g,NaCl 0.10 g,CaCl20.10 g,2 g/100 mL瓊脂粉,蒸餾水加至1 L。
碳源同化培養(yǎng)基:(NH4)2SO45.0 g,KH2PO40.85 g,K2HPO40.15 g,MgSO40.50 g,酵母浸膏0.88 g,葡萄糖(其他碳源)7.0 g,蒸餾水加至1 L。
EL204/EL3002電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;HH-8數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠;UV-2100紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯科學(xué)儀器有限公司;Finnigan Trace DSQ II氣相色譜儀、Trace GOLD TG-5SilMS毛細管色譜柱 美國Thermo Fisher科技公司。
1.3.1 酵母菌的分離、純化
酵母菌的分離采用稀釋平板涂布法。將高鹽稀態(tài)醬油醬渣樣品進行梯度稀釋,取0.1 mL樣品稀釋液(10-1和10-2)涂布于含10 g/100 mL NaCl的PDA固體培養(yǎng)基中,每個梯度進行2 個重復(fù)實驗,置于28 ℃培養(yǎng)2~3 d,挑取平板形態(tài)近似酵母且差異較大的單菌落進行鏡檢,將初步鏡檢為酵母的菌落進行多次平板劃線,獲得純培養(yǎng)菌株。純化后的菌株分別接種于斜面試管和甘油管中,置于-20 ℃進行保藏。
1.3.2 基因測序
1.3.2.1 基因組DNA提取
將分離得到的純培養(yǎng)酵母菌株送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行鑒定。酵母菌體依次通過十二烷基硫酸鈉、蛋白酶K和十六烷基三甲基溴化銨混勻水浴,離心后將沉淀溶于70%乙醇溶液,反復(fù)離心后得到的沉淀溶解于含RNase的純化水中,于4 ℃溶解過夜。
1.3.2.2 ITS rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建
將提取得到的酵母菌模板DNA進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增。使用ITS rDNA的通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’);采用30 μL PCR體系:17.8 μL H2O,3 μL Buffer,2 μL dNTP,3 μL Primer1,3 μL Primer2,1 μL模板DNA和0.2 μL酶。PCR條件:95 ℃預(yù)熱1 min,95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35 個循環(huán)后72 ℃末端延伸10 min,12 ℃保存。取3 μL PCR擴增產(chǎn)物,使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,然后對PCR產(chǎn)物進行上機測序。使用BLAST將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫進行同源性比對,并通過MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.3.3 酵母菌生長曲線的繪制
將已鑒定且活化后具有代表性的酵母菌株以3%接種量分別接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基,于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h,在0~72 h內(nèi)每隔3 h取樣測OD600nm值,繪制生長曲線。
1.3.4 酵母菌碳、氮源利用情況分析
參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]對分離得到的酵母菌株進行碳、氮源同化實驗。
碳源同化實驗:將菌種用無菌水制成菌懸液,調(diào)整細胞濃度至半透光,取80 μL菌懸液接入碳源同化培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)3~7 d后觀察菌株生長情況。所用碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、木糖和檸檬酸。
氮源同化實驗:將1 mL經(jīng)饑餓培養(yǎng)的菌懸液與氮源同化培養(yǎng)基混勻凝固,蘸取不同氮源化合物點在平板上,觀察菌株生長情況。所用氮源包括蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉。
1.3.5 酵母菌耐鹽性比較分析
將篩選的酵母菌株分別接入含有0、5、10、15、20、25 g/100 mL NaCl的麥芽汁培養(yǎng)基中,28 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h,觀察菌株生長情況,測定菌懸液OD600nm值,比較不同菌株之間的耐鹽性。
1.3.6 酵母菌醬油發(fā)酵體系
將未滅菌高鹽稀態(tài)釀造醬油的原油在90 ℃水浴加熱滅菌15 min,獲得滅菌醬油,將分離得到的各個純培養(yǎng)酵母菌株,分別在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后獲得酵母種子液,以105CFU/mL的接種量分別接種于滅菌醬油中,靜置于常溫發(fā)酵30 d后,對發(fā)酵終點的醬油樣品進行喜好度感官評分和風(fēng)味測定。
1.3.6.1 感官評定
由7 位經(jīng)過挑選、培訓(xùn)的感官評價人員(3 男4 女,20~31 歲)組成感官品評小組,對不同酵母發(fā)酵樣品進行感官評價,20 mL樣品裝入50 mL嗅聞瓶中,感評人員以對照組(未添加酵母菌的醬油)為0 分,分別對樣品進行喜好度評分,分值區(qū)間為-5(非常不喜歡)~5(非常喜歡),最終結(jié)果取感官得分平均值。感官實驗過程中,樣品嗅聞前需帶蓋稍微搖勻后靜置片刻,準備好后開蓋嗅聞并評分。
1.3.6.2 揮發(fā)性物質(zhì)的固相微萃取
揮發(fā)性化合物萃取的方法參照馮云子[2]已優(yōu)化的條件,并稍作調(diào)整。將醬油原油樣5 mL添加于頂空進樣瓶中,用NaCl調(diào)整樣品鹽質(zhì)量濃度至270 g/L,加入20 μL內(nèi)標(1.724 mg/L 2-甲基-3-庚酮甲醇溶液),使用75 μm CAR/PDMS萃取頭進行揮發(fā)性成分萃取。
采用TR-5ms彈性石英毛細色譜分析柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為高純氦氣(1.0 mL/min),采用電子電離離子源,電子能量70 eV,電子倍增器電壓350 V,離子掃描范圍m/z33~350,掃描速率3.00 scans/s,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度250 ℃,分流比10∶1。程序升溫條件:起始溫度40 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升到120 ℃,保持2 min,再以7 ℃/min升至220 ℃,保持5 min。
GC-MS化合物的定性分析通過NIST08譜庫及對比標準物質(zhì)科瓦茨保留指數(shù)(retention index,RI)完成,RI值通過正構(gòu)烷烴(C6~C33)計算得到。利用SPSS軟件(version 24.0,Chicago,Ill.,美國)進行方差分析,并通過Duncan進行差異顯著性分析(P<0.05,差異顯著),Origin(version 2018, OriginLab Corporation,Northampton,227 MA,美國)進行數(shù)據(jù)可視化處理;基于挑選出的關(guān)鍵香氣活性化合物,采用XLSTAT(version 2019,Addinsoft,New York,美國)進行主成分分析。
從醬渣分離菌株中挑選代表性的酵母菌進行基因測序鑒定,所有酵母的ITS rDNA基因序列系統(tǒng)進化樹如圖1所示。共分離得到14 株酵母,總計3 個菌屬和4 個菌種,包括9 株假絲酵母屬(Candida),3 株粉狀米勒氏酵母屬(Millerozyma)和2 株紅酵母屬(Rhodotorula)。
圖1 醬醪酵母ITS rDNA基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of moromi-derived yeast based on their ITS rDNA genes
鑒定的14 株酵母菌歸屬于4 個種,因此各挑選1 株代表性菌株進行生理生化特性實驗,以了解各類菌種的特性,測定結(jié)果如表1和圖2所示。鏡檢形態(tài)表明,粉狀米勒氏酵母(M.farinosa)以瓜子橢圓形的形態(tài)為主,而膠紅酵母(R.mucilaginosa)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)和似平滑假絲酵母(C.metapsilosis)均以橢圓形為主。平板形態(tài)觀察結(jié)果表明,膠紅酵母表現(xiàn)為橙色圓形且表面隆起的小菌落,近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母均表現(xiàn)為白色圓形小菌落,表面濕潤,均符合《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]中菌種形態(tài)特征。而粉狀米勒氏酵母表現(xiàn)為表面干燥褶皺,邊緣不齊且不隆起的圓形白色大菌落,與Maresova等[14]研究該菌種的形態(tài)一致。
表1 4 株醬醪酵母的菌落特征及其生理生化測定結(jié)果Table 1 Colony features and biochemical characteristics of four strains of moromi-derived yeast
圖2 4 株醬醪酵母的菌落平板及鏡檢形態(tài)Fig.2 Colony and microscopic morphology of four strains of moromi-derived yeast
4 株代表性酵母菌株碳、氮源利用情況如表2所示。以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源時,各菌株均能正常生長;但乳糖、木糖和檸檬酸作為碳源時,各酵母菌株生長情況不一致。在乳糖培養(yǎng)液中,各酵母菌株均不能生長,而在木糖培養(yǎng)液中只觀察到膠紅酵母和粉狀米勒氏酵母的增殖;此外,只有粉狀米勒氏酵母能夠利用檸檬酸繁殖,與Tolieng等[15]報道該菌種利用碳源的情況一致。在氮源中,蛋白胨和尿素培養(yǎng)液中均能觀察到各酵母菌株的生長,且近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母均不能同化硝酸鈉,而膠紅酵母不能同化硫酸銨及硝酸鈉;與《酵母菌的特征與鑒定手冊》[13]中各菌種的同化結(jié)果相符。
表2 碳、氮源對4 株醬醪酵母菌生長的影響Table 2 Effects of different carbon and nitrogen sources on the growth of four strains of moromi-derived yeast
由圖3a可知,似平滑假絲酵母菌生長活力最強,3~18 h處于對數(shù)生長期,20 h以后為穩(wěn)定期。此外,粉狀米勒氏酵母和近平滑假絲酵母的生長規(guī)律相類似,3~25 h為對數(shù)生長期,25 h以后為穩(wěn)定期。膠紅酵母的生長曲線則明顯區(qū)別于其他3 株酵母,進入對數(shù)生長期較晚,表現(xiàn)為0~13 h處于延遲期,13~45 h為對數(shù)生長期。
高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中NaCl質(zhì)量濃度在17~18 g/100 mL左右,菌株的耐鹽性是醬油功能菌株發(fā)揮作用的一個重要基礎(chǔ)。圖3b結(jié)果表明,在0~5 g/100 mL的NaCl質(zhì)量濃度下,各菌株均能正常繁殖,當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度高于10 g/100 mL時,近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母的生長均受到抑制,NaCl質(zhì)量濃度越高,生長受抑制的程度越大,在NaCl質(zhì)量濃度高于15 g/100 mL時,粉狀米勒氏酵母的生長受到明顯抑制,結(jié)果表明粉狀米勒氏酵母的耐鹽性強于近平滑假絲酵母,與Suzuki[16]研究中粉狀米勒氏酵母耐鹽性較強的結(jié)果一致。而膠紅酵母在高鹽環(huán)境下生長趨勢的變化不明顯,能夠保持穩(wěn)定增長。
圖3 醬醪酵母的生長曲線(a)和耐鹽性(b)Fig.3 Growth curves (a) and salt tolerance (b) of four strains of moromi-derived yeast
由圖4A可知,共有8 株酵母發(fā)酵后的醬油氣味喜好度得分為正值,包括4 株似平滑假絲酵母、2 株膠紅酵母和2 株近平滑假絲酵母,其中似平滑假絲酵母SWJS W320和膠紅酵母SWJS W201評分最高。而6 株酵母發(fā)酵后的樣品得分為負值,包括3 株粉狀米勒氏酵母和3 株近平滑假絲酵母,其中粉狀米勒氏酵母(SWJS W214、SWJS W323、SWJS W213)的感官評分最低,風(fēng)味喜好度顯著低于其他菌株(P<0.05),其繁殖對醬油風(fēng)味有明顯的負面效果。然而,彭東等[17]研究認為粉狀米勒氏酵母發(fā)酵后具有水果香和麥芽香,是具有潛力的醬油釀造生香酵母,與本研究結(jié)果不一致,這可能是由于嗅聞樣品制備方法的差異引起,彭東等[17]研究中,感官評價樣品采用160 g/L NaCl豆芽汁液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)7 d制備,而本研究直接將微生物接種到醬油中進行嗅聞,更能還原其在醬油發(fā)酵中的作用效果。
圖4 14 株酵母菌發(fā)酵樣品感官得分(A)和揮發(fā)性組分類別組成(B)Fig.4 Sensory scores (A) and volatile components (B) of soy sauce samples fermented with 14 yeast strains
如圖4B所示,GC-MS共鑒定的105 種揮發(fā)性化合物可分為10 大類,包括酯類(21 種)、酮類(16 種)、醛類(15 種)、呋喃(酮)類(13 種)、吡嗪類(10 種)、含硫類化合物(7 種)、酸類(6 種)、醇類(7 種)、酚類(3 種)和其他類化合物(7 種)。對照本團隊前期醬油揮發(fā)性物質(zhì)檢出總結(jié)[2],大部分化合物已有相關(guān)報道[18-19]。整體而言,3 個粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品(SWJS W214、SWJS W323、SWJS W213)揮發(fā)性物質(zhì)組成明顯不同于其他菌種,醇類平均占比為74.4%,酸類僅2.7%,此外,酮類物質(zhì)占比明顯提升,這表明粉狀米勒氏酵母的代謝特性較為特殊[20];該菌在醬油中的繁殖改變了醬油原有風(fēng)味的平衡和特性,可能是該系列樣品感官評分最低的原因。另外的11 個樣品醇和酸在所有揮發(fā)性成分中占比最高,平均占比分別約為19.6%和43.4%,且樣品組中酸、醛、呋喃類物質(zhì)百分比含量均高于對照組,酚類和含硫化合物低于對照組。
基于各樣品中48 個關(guān)鍵香氣活性化合物的峰面積結(jié)果,對其進行主成分分析。如圖5A所示,因14 個酵母發(fā)酵樣品在圖中分布象限不同,可將其分為2 個樣品組。樣品組1包括3 株粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品,位于第2、3象限,樣品組2包括膠紅酵母、近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母發(fā)酵樣品,均分散在第4象限,且與落在第1象限的對照組距離較遠。
如圖5B所示,有17 種揮發(fā)性物質(zhì)位于第2、3象限,主要包括1,2,3-三甲氧基苯、2-壬酮、2-辛酮、2-甲氧基苯酚、2-戊酮、3-甲基丁酸,苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸甲酯等。與對照組相比,這些物質(zhì)在粉狀米勒氏酵母中含量明顯提升,其中2-辛酮和2-壬酮含量均提升約60 倍,且1,2,3-三甲氧基苯僅在該菌種對應(yīng)樣品中檢出,被報道具有異味特征[2]的3-甲基丁酸也提升約5 倍,這一結(jié)果可能是造成感官得分較低(圖4)的主要原因。有研究表明α-酮酸在氨基轉(zhuǎn)移酶作用下形成相應(yīng)的酮[21],酮類物質(zhì)含量大幅提高,側(cè)面說明粉狀米勒氏酵母中該酶活性較強。另外,粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品中苯乙醛含量降低而苯乙醇含量明顯增加,前人研究報道中苯乙醛在醇脫氫酶作用下還原形成苯乙醇[22],說明該菌種可能對這一過程具有明顯促進作用,與Choi等[23]研究粉狀酵母發(fā)酵飲料中苯乙醇含量較高的結(jié)果一致。綜上,粉狀米勒氏酵母的代謝特點具有明顯差異,且大量繁殖時會產(chǎn)生不良風(fēng)味。
圖5 酵母單獨發(fā)酵樣品揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.5 PCA score plot (A) and loading plot (B) of volatile substances in soy sauce samples fermented using pure yeast strains
此外,2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、苯乙醛等物質(zhì)均落在第4象限。相對于對照組,近平滑假絲酵母可以提升甲硫醇、3-甲基-2-丁烯醛、2,6-二甲基吡嗪等物質(zhì)的含量。而膠紅酵母和似平滑假絲酵母可以提升苯乙醇、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、苯甲醛和2,6-二甲基吡嗪等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的峰面積含量,這些物質(zhì)均被報道為重要的活性風(fēng)味成分[24-25],其中3-甲硫基丙醛和2-苯乙酸乙酯被報道分別賦予獨特的烤土豆香[26]和玫瑰花香[27],與感官得分結(jié)果(圖4)相符。膠紅酵母被報道具有較高的油脂合成能力,可用于生產(chǎn)類胡蘿卜素和類脂化合物[28-29]。綜上所述,膠紅酵母和似平滑假絲酵母具有一定醬油生香酵母的開發(fā)潛力。
從高鹽稀態(tài)醬油醬渣中篩選分離得到14 株功能酵母菌,包括膠紅酵母、粉狀米勒氏酵母、近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母4 個菌種類型,選取代表性菌株研究菌落形態(tài)和生理生化特征。通過醬油體系菌株單獨發(fā)酵產(chǎn)香并結(jié)合嗅聞感官評價,鑒定出對醬油風(fēng)味具有負面影響的粉狀米勒氏酵母和近平滑假絲酵母。特別是粉狀米勒氏酵母,其菌落表面干燥褶皺,是醬油風(fēng)味的有害酵母,其大量繁殖將大幅提高醬油中2-辛酮、2-壬酮和1,2,3-三甲氧基苯的含量,帶來明顯的不良風(fēng)味。另外,篩選到對醬油風(fēng)味具有提升潛力的膠紅酵母和似平滑假絲酵母,可以提高苯乙醇、2-苯乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪和3-甲硫基丙醛等風(fēng)味活性物質(zhì)含量。本研究僅考慮了單菌種的風(fēng)味貢獻效果,而在實際醬油發(fā)酵體系中,還需要考慮與其他菌群的交互作用,如常用的生香魯氏結(jié)合酵母等。因此,具有潛力的風(fēng)味功能酵母菌將進一步加入到醬油發(fā)酵過程中進行風(fēng)味貢獻驗證,并且在釀造過程中如何提升有益菌種的作用,同時抑制有害酵母的繁殖代謝值得進一步深入研究。