高鹽稀態(tài)醬醪中功能性酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵特性

王靖雯，趙謀明，陳 濤，張佳匯，陳子杰，馮云子,*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.上海太太樂(lè)食品有限公司，上海 201206）

醬油是一種起源于中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味受到了全世界人民的喜愛(ài)[1]。醬油發(fā)酵包含兩個(gè)步驟，即制曲和醬醪發(fā)酵。制曲階段以米曲霉的生長(zhǎng)和作用為主，隨著醬醪發(fā)酵階段的推進(jìn)，米曲霉的作用減弱，耐鹽酵母菌和乳酸菌不斷增殖，代謝形成豐富的物質(zhì)，包括氨基酸類、糖類、糖醇類、有機(jī)酸類、醇類和酯類等揮發(fā)性化合物，對(duì)提高醬油的風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[2-4]。其中，耐鹽酵母菌對(duì)醬油揮發(fā)性物質(zhì)的積累具有重要作用[5]。

隨著風(fēng)味感官組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展以及醬油香氣活性物質(zhì)的鑒定，許多研究逐漸轉(zhuǎn)向酵母對(duì)醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。其中報(bào)道次數(shù)較多的有耐鹽生香酵母包括魯氏結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）和易變假絲酵母（Candida versatilis）等。Yao Shangjie等[6]研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種魯氏結(jié)合酵母可以提升苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等醇類物質(zhì)的含量。Wah等[7]從醬油發(fā)酵1 個(gè)月的醬醪中分離得到嗜鹽的季也蒙畢赤酵母，發(fā)現(xiàn)其單獨(dú)接種發(fā)酵后的醬油中愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚的含量明顯提升。張玲[8]研究新發(fā)現(xiàn)添加易變假絲酵母可以促進(jìn)乙醇、乙酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚、甲基吡嗪、苯乙醛和4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮等風(fēng)味活性物質(zhì)含量的提升。除單菌種發(fā)酵對(duì)風(fēng)味影響的研究外，功能菌株混合培養(yǎng)的應(yīng)用逐漸成為熱點(diǎn)。Singracha等[9]發(fā)現(xiàn)魯氏結(jié)合酵母與季也蒙畢赤酵母共同接種發(fā)酵的醬油中乙醇、2-甲基-1-丙醇、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和3-羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮（麥芽酚）等物質(zhì)含量明顯高于單獨(dú)接種魯氏結(jié)合酵母發(fā)酵的醬油。通過(guò)總結(jié)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[10-12]中鑒定醬油酵母菌的種屬信息，共統(tǒng)計(jì)18 個(gè)菌屬，關(guān)于醬油酵母菌的相關(guān)研究有待深入，特別是一些含量較低的功能菌種有待挖掘。

因此，本研究擬從高鹽稀態(tài)醬油醬渣中篩選分離功能酵母菌，結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)確定其種屬，選擇代表性菌株進(jìn)行生理生化鑒定并探究其生長(zhǎng)特性，將分離純化的酵母菌種單獨(dú)接種到醬油體系培養(yǎng)，結(jié)合感官評(píng)價(jià)和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析判斷其風(fēng)味代謝特點(diǎn)，以期為醬油酵母資源的開(kāi)發(fā)及發(fā)酵風(fēng)味調(diào)控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵終點(diǎn)的醬渣樣品，取自廣東省某醬油廠。

氫氧化鈉、NaCl、鹽酸、葡萄糖、硫酸鎂、甲基紅指示劑、溴酚藍(lán)指示劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、2-辛醇、2-甲基-3-庚酮（均為分析純） Sigma（上海）有限公司；PDA固體培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱有限公司。

氮源同化培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4（其他氮源）5.0 g，KH2PO40.85 g，K2HPO40.15 g，MgSO40.50 g，NaCl 0.10 g，CaCl20.10 g，2 g/100 mL瓊脂粉，蒸餾水加至1 L。

碳源同化培養(yǎng)基：(NH4)2SO45.0 g，KH2PO40.85 g，K2HPO40.15 g，MgSO40.50 g，酵母浸膏0.88 g，葡萄糖（其他碳源）7.0 g，蒸餾水加至1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204/EL3002電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；HH-8數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠；UV-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯科學(xué)儀器有限公司；Finnigan Trace DSQ II氣相色譜儀、Trace GOLD TG-5SilMS毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Thermo Fisher科技公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離、純化

酵母菌的分離采用稀釋平板涂布法。將高鹽稀態(tài)醬油醬渣樣品進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL樣品稀釋液（10-1和10-2）涂布于含10 g/100 mL NaCl的PDA固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度進(jìn)行2 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，置于28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑取平板形態(tài)近似酵母且差異較大的單菌落進(jìn)行鏡檢，將初步鏡檢為酵母的菌落進(jìn)行多次平板劃線，獲得純培養(yǎng)菌株。純化后的菌株分別接種于斜面試管和甘油管中，置于-20 ℃進(jìn)行保藏。

1.3.2 基因測(cè)序

1.3.2.1 基因組DNA提取

將分離得到的純培養(yǎng)酵母菌株送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行鑒定。酵母菌體依次通過(guò)十二烷基硫酸鈉、蛋白酶K和十六烷基三甲基溴化銨混勻水浴，離心后將沉淀溶于70%乙醇溶液，反復(fù)離心后得到的沉淀溶解于含RNase的純化水中，于4 ℃溶解過(guò)夜。

1.3.2.2 ITS rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將提取得到的酵母菌模板DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。使用ITS rDNA的通用引物（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；采用30 μL PCR體系：17.8 μL H2O，3 μL Buffer，2 μL dNTP，3 μL Primer1，3 μL Primer2，1 μL模板DNA和0.2 μL酶。PCR條件：95 ℃預(yù)熱1 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃末端延伸10 min，12 ℃保存。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。使用BLAST將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，并通過(guò)MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 酵母菌生長(zhǎng)曲線的繪制

將已鑒定且活化后具有代表性的酵母菌株以3%接種量分別接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h，在0～72 h內(nèi)每隔3 h取樣測(cè)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 酵母菌碳、氮源利用情況分析

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[13]對(duì)分離得到的酵母菌株進(jìn)行碳、氮源同化實(shí)驗(yàn)。

碳源同化實(shí)驗(yàn)：將菌種用無(wú)菌水制成菌懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至半透光，取80 μL菌懸液接入碳源同化培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3～7 d后觀察菌株生長(zhǎng)情況。所用碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、木糖和檸檬酸。

氮源同化實(shí)驗(yàn)：將1 mL經(jīng)饑餓培養(yǎng)的菌懸液與氮源同化培養(yǎng)基混勻凝固，蘸取不同氮源化合物點(diǎn)在平板上，觀察菌株生長(zhǎng)情況。所用氮源包括蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉。

1.3.5 酵母菌耐鹽性比較分析

將篩選的酵母菌株分別接入含有0、5、10、15、20、25 g/100 mL NaCl的麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)72 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，測(cè)定菌懸液OD600nm值，比較不同菌株之間的耐鹽性。

1.3.6 酵母菌醬油發(fā)酵體系

將未滅菌高鹽稀態(tài)釀造醬油的原油在90 ℃水浴加熱滅菌15 min，獲得滅菌醬油，將分離得到的各個(gè)純培養(yǎng)酵母菌株，分別在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后獲得酵母種子液，以105CFU/mL的接種量分別接種于滅菌醬油中，靜置于常溫發(fā)酵30 d后，對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)的醬油樣品進(jìn)行喜好度感官評(píng)分和風(fēng)味測(cè)定。

1.3.6.1 感官評(píng)定

由7 位經(jīng)過(guò)挑選、培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)人員（3 男4 女，20～31 歲）組成感官品評(píng)小組，對(duì)不同酵母發(fā)酵樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，20 mL樣品裝入50 mL嗅聞瓶中，感評(píng)人員以對(duì)照組（未添加酵母菌的醬油）為0 分，分別對(duì)樣品進(jìn)行喜好度評(píng)分，分值區(qū)間為-5（非常不喜歡）～5（非常喜歡），最終結(jié)果取感官得分平均值。感官實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品嗅聞前需帶蓋稍微搖勻后靜置片刻，準(zhǔn)備好后開(kāi)蓋嗅聞并評(píng)分。

1.3.6.2 揮發(fā)性物質(zhì)的固相微萃取

揮發(fā)性化合物萃取的方法參照馮云子[2]已優(yōu)化的條件，并稍作調(diào)整。將醬油原油樣5 mL添加于頂空進(jìn)樣瓶中，用NaCl調(diào)整樣品鹽質(zhì)量濃度至270 g/L，加入20 μL內(nèi)標(biāo)（1.724 mg/L 2-甲基-3-庚酮甲醇溶液），使用75 μm CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行揮發(fā)性成分萃取。

采用TR-5ms彈性石英毛細(xì)色譜分析柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（1.0 mL/min），采用電子電離離子源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓350 V，離子掃描范圍m/z33～350，掃描速率3.00 scans/s，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，分流比10∶1。程序升溫條件：起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

GC-MS化合物的定性分析通過(guò)NIST08譜庫(kù)及對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)科瓦茨保留指數(shù)（retention index，RI）完成，RI值通過(guò)正構(gòu)烷烴（C6～C33）計(jì)算得到。利用SPSS軟件（version 24.0，Chicago，Ill.，美國(guó)）進(jìn)行方差分析，并通過(guò)Duncan進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），Origin（version 2018, OriginLab Corporation,Northampton，227 MA，美國(guó)）進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理；基于挑選出的關(guān)鍵香氣活性化合物，采用XLSTAT（version 2019，Addinsoft，New York，美國(guó)）進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株基因鑒定結(jié)果

從醬渣分離菌株中挑選代表性的酵母菌進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，所有酵母的ITS rDNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。共分離得到14 株酵母，總計(jì)3 個(gè)菌屬和4 個(gè)菌種，包括9 株假絲酵母屬（Candida），3 株粉狀米勒氏酵母屬（Millerozyma）和2 株紅酵母屬（Rhodotorula）。

圖1 醬醪酵母ITS rDNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of moromi-derived yeast based on their ITS rDNA genes

2.2 醬醅酵母菌落形態(tài)觀察結(jié)果

鑒定的14 株酵母菌歸屬于4 個(gè)種，因此各挑選1 株代表性菌株進(jìn)行生理生化特性實(shí)驗(yàn)，以了解各類菌種的特性，測(cè)定結(jié)果如表1和圖2所示。鏡檢形態(tài)表明，粉狀米勒氏酵母（M.farinosa）以瓜子橢圓形的形態(tài)為主，而膠紅酵母（R.mucilaginosa）、近平滑假絲酵母（C.parapsilosis）和似平滑假絲酵母（C.metapsilosis）均以橢圓形為主。平板形態(tài)觀察結(jié)果表明，膠紅酵母表現(xiàn)為橙色圓形且表面隆起的小菌落，近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母均表現(xiàn)為白色圓形小菌落，表面濕潤(rùn)，均符合《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[13]中菌種形態(tài)特征。而粉狀米勒氏酵母表現(xiàn)為表面干燥褶皺，邊緣不齊且不隆起的圓形白色大菌落，與Maresova等[14]研究該菌種的形態(tài)一致。

表1 4 株醬醪酵母的菌落特征及其生理生化測(cè)定結(jié)果Table 1 Colony features and biochemical characteristics of four strains of moromi-derived yeast

圖2 4 株醬醪酵母的菌落平板及鏡檢形態(tài)Fig.2 Colony and microscopic morphology of four strains of moromi-derived yeast

2.3 碳、氮源利用情況分析

4 株代表性酵母菌株碳、氮源利用情況如表2所示。以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源時(shí)，各菌株均能正常生長(zhǎng)；但乳糖、木糖和檸檬酸作為碳源時(shí)，各酵母菌株生長(zhǎng)情況不一致。在乳糖培養(yǎng)液中，各酵母菌株均不能生長(zhǎng)，而在木糖培養(yǎng)液中只觀察到膠紅酵母和粉狀米勒氏酵母的增殖；此外，只有粉狀米勒氏酵母能夠利用檸檬酸繁殖，與Tolieng等[15]報(bào)道該菌種利用碳源的情況一致。在氮源中，蛋白胨和尿素培養(yǎng)液中均能觀察到各酵母菌株的生長(zhǎng)，且近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母均不能同化硝酸鈉，而膠紅酵母不能同化硫酸銨及硝酸鈉；與《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[13]中各菌種的同化結(jié)果相符。

表2 碳、氮源對(duì)4 株醬醪酵母菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different carbon and nitrogen sources on the growth of four strains of moromi-derived yeast

2.4 酵母菌株生長(zhǎng)曲線及耐鹽性分析

由圖3a可知，似平滑假絲酵母菌生長(zhǎng)活力最強(qiáng)，3～18 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h以后為穩(wěn)定期。此外，粉狀米勒氏酵母和近平滑假絲酵母的生長(zhǎng)規(guī)律相類似，3～25 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，25 h以后為穩(wěn)定期。膠紅酵母的生長(zhǎng)曲線則明顯區(qū)別于其他3 株酵母，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較晚，表現(xiàn)為0～13 h處于延遲期，13～45 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程中NaCl質(zhì)量濃度在17～18 g/100 mL左右，菌株的耐鹽性是醬油功能菌株發(fā)揮作用的一個(gè)重要基礎(chǔ)。圖3b結(jié)果表明，在0～5 g/100 mL的NaCl質(zhì)量濃度下，各菌株均能正常繁殖，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度高于10 g/100 mL時(shí)，近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母的生長(zhǎng)均受到抑制，NaCl質(zhì)量濃度越高，生長(zhǎng)受抑制的程度越大，在NaCl質(zhì)量濃度高于15 g/100 mL時(shí)，粉狀米勒氏酵母的生長(zhǎng)受到明顯抑制，結(jié)果表明粉狀米勒氏酵母的耐鹽性強(qiáng)于近平滑假絲酵母，與Suzuki[16]研究中粉狀米勒氏酵母耐鹽性較強(qiáng)的結(jié)果一致。而膠紅酵母在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)趨勢(shì)的變化不明顯，能夠保持穩(wěn)定增長(zhǎng)。

圖3 醬醪酵母的生長(zhǎng)曲線（a）和耐鹽性（b）Fig.3 Growth curves (a) and salt tolerance (b) of four strains of moromi-derived yeast

2.5 感官評(píng)價(jià)和GC-MS分析結(jié)果

由圖4A可知，共有8 株酵母發(fā)酵后的醬油氣味喜好度得分為正值，包括4 株似平滑假絲酵母、2 株膠紅酵母和2 株近平滑假絲酵母，其中似平滑假絲酵母SWJS W320和膠紅酵母SWJS W201評(píng)分最高。而6 株酵母發(fā)酵后的樣品得分為負(fù)值，包括3 株粉狀米勒氏酵母和3 株近平滑假絲酵母，其中粉狀米勒氏酵母（SWJS W214、SWJS W323、SWJS W213）的感官評(píng)分最低，風(fēng)味喜好度顯著低于其他菌株（P＜0.05），其繁殖對(duì)醬油風(fēng)味有明顯的負(fù)面效果。然而，彭東等[17]研究認(rèn)為粉狀米勒氏酵母發(fā)酵后具有水果香和麥芽香，是具有潛力的醬油釀造生香酵母，與本研究結(jié)果不一致，這可能是由于嗅聞樣品制備方法的差異引起，彭東等[17]研究中，感官評(píng)價(jià)樣品采用160 g/L NaCl豆芽汁液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)7 d制備，而本研究直接將微生物接種到醬油中進(jìn)行嗅聞，更能還原其在醬油發(fā)酵中的作用效果。

圖4 14 株酵母菌發(fā)酵樣品感官得分（A）和揮發(fā)性組分類別組成（B）Fig.4 Sensory scores (A) and volatile components (B) of soy sauce samples fermented with 14 yeast strains

如圖4B所示，GC-MS共鑒定的105 種揮發(fā)性化合物可分為10 大類，包括酯類（21 種）、酮類（16 種）、醛類（15 種）、呋喃（酮）類（13 種）、吡嗪類（10 種）、含硫類化合物（7 種）、酸類（6 種）、醇類（7 種）、酚類（3 種）和其他類化合物（7 種）。對(duì)照本團(tuán)隊(duì)前期醬油揮發(fā)性物質(zhì)檢出總結(jié)[2]，大部分化合物已有相關(guān)報(bào)道[18-19]。整體而言，3 個(gè)粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品（SWJS W214、SWJS W323、SWJS W213）揮發(fā)性物質(zhì)組成明顯不同于其他菌種，醇類平均占比為74.4%，酸類僅2.7%，此外，酮類物質(zhì)占比明顯提升，這表明粉狀米勒氏酵母的代謝特性較為特殊[20]；該菌在醬油中的繁殖改變了醬油原有風(fēng)味的平衡和特性，可能是該系列樣品感官評(píng)分最低的原因。另外的11 個(gè)樣品醇和酸在所有揮發(fā)性成分中占比最高，平均占比分別約為19.6%和43.4%，且樣品組中酸、醛、呋喃類物質(zhì)百分比含量均高于對(duì)照組，酚類和含硫化合物低于對(duì)照組。

基于各樣品中48 個(gè)關(guān)鍵香氣活性化合物的峰面積結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行主成分分析。如圖5A所示，因14 個(gè)酵母發(fā)酵樣品在圖中分布象限不同，可將其分為2 個(gè)樣品組。樣品組1包括3 株粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品，位于第2、3象限，樣品組2包括膠紅酵母、近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母發(fā)酵樣品，均分散在第4象限，且與落在第1象限的對(duì)照組距離較遠(yuǎn)。

如圖5B所示，有17 種揮發(fā)性物質(zhì)位于第2、3象限，主要包括1,2,3-三甲氧基苯、2-壬酮、2-辛酮、2-甲氧基苯酚、2-戊酮、3-甲基丁酸，苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸甲酯等。與對(duì)照組相比，這些物質(zhì)在粉狀米勒氏酵母中含量明顯提升，其中2-辛酮和2-壬酮含量均提升約60 倍，且1,2,3-三甲氧基苯僅在該菌種對(duì)應(yīng)樣品中檢出，被報(bào)道具有異味特征[2]的3-甲基丁酸也提升約5 倍，這一結(jié)果可能是造成感官得分較低（圖4）的主要原因。有研究表明α-酮酸在氨基轉(zhuǎn)移酶作用下形成相應(yīng)的酮[21]，酮類物質(zhì)含量大幅提高，側(cè)面說(shuō)明粉狀米勒氏酵母中該酶活性較強(qiáng)。另外，粉狀米勒氏酵母發(fā)酵樣品中苯乙醛含量降低而苯乙醇含量明顯增加，前人研究報(bào)道中苯乙醛在醇脫氫酶作用下還原形成苯乙醇[22]，說(shuō)明該菌種可能對(duì)這一過(guò)程具有明顯促進(jìn)作用，與Choi等[23]研究粉狀酵母發(fā)酵飲料中苯乙醇含量較高的結(jié)果一致。綜上，粉狀米勒氏酵母的代謝特點(diǎn)具有明顯差異，且大量繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味。

圖5 酵母單獨(dú)發(fā)酵樣品揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.5 PCA score plot (A) and loading plot (B) of volatile substances in soy sauce samples fermented using pure yeast strains

此外，2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、苯乙醛等物質(zhì)均落在第4象限。相對(duì)于對(duì)照組，近平滑假絲酵母可以提升甲硫醇、3-甲基-2-丁烯醛、2,6-二甲基吡嗪等物質(zhì)的含量。而膠紅酵母和似平滑假絲酵母可以提升苯乙醇、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基-1-丙醇、2-苯乙酸乙酯、苯甲醛和2,6-二甲基吡嗪等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的峰面積含量，這些物質(zhì)均被報(bào)道為重要的活性風(fēng)味成分[24-25]，其中3-甲硫基丙醛和2-苯乙酸乙酯被報(bào)道分別賦予獨(dú)特的烤土豆香[26]和玫瑰花香[27]，與感官得分結(jié)果（圖4）相符。膠紅酵母被報(bào)道具有較高的油脂合成能力，可用于生產(chǎn)類胡蘿卜素和類脂化合物[28-29]。綜上所述，膠紅酵母和似平滑假絲酵母具有一定醬油生香酵母的開(kāi)發(fā)潛力。

3 結(jié) 論

從高鹽稀態(tài)醬油醬渣中篩選分離得到14 株功能酵母菌，包括膠紅酵母、粉狀米勒氏酵母、近平滑假絲酵母和似平滑假絲酵母4 個(gè)菌種類型，選取代表性菌株研究菌落形態(tài)和生理生化特征。通過(guò)醬油體系菌株單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)香并結(jié)合嗅聞感官評(píng)價(jià)，鑒定出對(duì)醬油風(fēng)味具有負(fù)面影響的粉狀米勒氏酵母和近平滑假絲酵母。特別是粉狀米勒氏酵母，其菌落表面干燥褶皺，是醬油風(fēng)味的有害酵母，其大量繁殖將大幅提高醬油中2-辛酮、2-壬酮和1,2,3-三甲氧基苯的含量，帶來(lái)明顯的不良風(fēng)味。另外，篩選到對(duì)醬油風(fēng)味具有提升潛力的膠紅酵母和似平滑假絲酵母，可以提高苯乙醇、2-苯乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪和3-甲硫基丙醛等風(fēng)味活性物質(zhì)含量。本研究?jī)H考慮了單菌種的風(fēng)味貢獻(xiàn)效果，而在實(shí)際醬油發(fā)酵體系中，還需要考慮與其他菌群的交互作用，如常用的生香魯氏結(jié)合酵母等。因此，具有潛力的風(fēng)味功能酵母菌將進(jìn)一步加入到醬油發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行風(fēng)味貢獻(xiàn)驗(yàn)證，并且在釀造過(guò)程中如何提升有益菌種的作用，同時(shí)抑制有害酵母的繁殖代謝值得進(jìn)一步深入研究。