米糠蛋白O/W及W/O/W乳液制備及界面穩(wěn)定性

王可心，段慶松，王依凡，段玉敏，霍金杰，江睿生，何 東，高育哲,*，肖志剛,,*

（1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；3.沈陽師范大學實驗中心，遼寧 沈陽 110034）

米糠是稻米加工的副產物，含有15%～22%脂肪，7%～11.4%纖維，34.1%～52.3%碳水化合物及10%～16%蛋白[1]，是糧油副產物中蛋白質含量較高且產量較大的一種可再生資源[2]。其蛋白質主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白4 種組分構成[3]，氨基酸組成與比例和聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織推薦模式接近。米糠蛋白消化率高達92%，生物效價大約為2.0～2.5，優(yōu)于大豆蛋白、玉米蛋白和小麥蛋白。米糠蛋白還具有低致敏性的特點，可以添加到嬰幼兒食品中[4]。

蛋白質乳液的成因是具有兩親性質的蛋白質在油-水界面吸附，其二級和三級結構重排，相鄰蛋白質分子通過疏水性或二硫鍵相互吸附，在水-油界面進一步聚合形成黏彈性保護層，從而形成乳液液滴并在液滴之間防止乳液發(fā)生聚結和絮凝[5]。蛋白質乳液也有多種形態(tài)，通常分為單層乳液和多重乳液。單層乳液通常有W/O和O/W 2 種形態(tài)；多重乳液，通常指雙重乳液，是指乳液內分散著更小的乳液系統(tǒng)，可以看成乳液中的乳液，常見類型為W/O/W型和O/W/O型[6]。因結構特殊，雙重乳液可以更好地包埋活性物質免受胃腸環(huán)境的破壞[7]以及控制包埋物質的緩釋速度[8]，成為近年來研究熱點。

米糠蛋白剛性強、親水基團和疏水基團被隱藏在高度卷曲的結構中，致使其乳液界面穩(wěn)定性較差。雙重乳液在基料種類和制備方法上選擇較多，目前雙乳化研究的熱點大多數(shù)為復合顆粒、改性淀粉或乳清蛋白，對于天然植物蛋白的研究鮮有報道，且其與單層乳液穩(wěn)定性的區(qū)別與機理還有待研究。因此，本研究制備W/O/W雙乳液，考察不同米糠蛋白質量濃度下，乳液的微觀結構及其對乳液穩(wěn)定性的影響規(guī)律，對比O/W乳液及W/O/W乳液的形成及穩(wěn)定規(guī)律。進一步研究雙乳化法對天然米糠蛋白乳液的穩(wěn)定機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠 沈陽奧達油脂有限公司；大豆油 嘉里糧油（中國）有限公司；聚甘油蓖麻油酸醇酯PGPR 90山東優(yōu)索華工科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LD4-2型低速離心機 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；ULTRA TURRAX?T25高速分散機 德國IKA公司；BX50光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；TSC SP8激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；Zeta sizer Nano-ZS90激光粒度分析儀、Master sizer 3000激光粒度儀英國馬爾文公司；RVDV-3 Ultra流變儀 美國博勒飛公司；UV-1200S型紫外-可見分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白的提取

參照周聳勵[9]的方法并稍作修改。脫脂米糠中加入10 倍體積的蒸餾水，調pH值至9.5，于室溫攪拌0.5 h，5 000 r/min離心15 min，收集上清液；沉淀重復操作，并合并上清液，調至等電點pH 4.5，4 ℃靜置0.5 h，5 000 r/min離心15 min，沉淀調節(jié)為中性，凱氏定氮確定蛋白含量。

1.3.2 米糠蛋白乳液的制備

取一定量的大豆油，加入5 g/100 mL的PGPR 90作為穩(wěn)定劑，于室溫600 r/min攪拌1 h作為油相備用。

1.3.2.1 米糠蛋白O/W乳液的制備

以乳液目標總體積為基準，配制質量濃度為0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 mL以及2.5 g/100 mL的米糠蛋白溶液并與油相按6∶4（V/V）的比例混合，于高速均質機9 500 r/min室溫均質1 min。

1.3.2.2 米糠蛋白W/O/W乳液的制備

參照Ali[10]及Natalie[11]等的方法并修改。以乳液目標總體積為基準，配制質量濃度為0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100 mL以及2.5 g/100 mL的米糠蛋白溶液并與油相按1∶4（V/V）的比例混合，高速均質機轉速13 500 r/min處理40 s；再將處理后的乳液按1∶1（V/V）的比例加入去離子水，高速均質機轉速9 500 r/min處理1 min。

1.3.3 乳液微觀結構測定

1.3.3.1 光學顯微鏡觀測成像

取不同乳液樣品適當稀釋后滴加到帶凹槽載玻片中央，加蓋蓋玻片，置于光學顯微鏡載物臺上，用40 倍光學顯微鏡進行觀察。利用儀器自帶軟件獲得乳液顯微結構圖像。

1.3.3.2 光共聚焦顯微鏡成像

參照王麗娟[12]的方法對乳液進行染色處理，并稍作調整。采用0.1%尼羅紅和0.1%尼羅藍分別對油相與蛋白相進行染色。在激發(fā)波長488 nm時，將綠色作為油相熒光信號；激發(fā)波長633 nm時，采用紅色作為蛋白質熒光信號。掃描頻率為100 Hz，掃描密度為1 024×1 024。使用LAS AF Lite軟件進行圖像處理。

1.3.4 表觀穩(wěn)定性的測定

取等量乳液于10 mL離心管中倒置于黑色背景前，分別于0、24 h和48 h對乳液的表觀狀態(tài)進行圖像采集。

1.3.5 乳化活性及乳液穩(wěn)定性的測定

參考鞠夢楠等[13]的方法并稍作修改。取10 mL新制乳液置于20 mL小瓶中，瞬時用移液槍在瓶底取20 μL加入至5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中。以0.1%的SDS溶液作為空白對照，于波長500 nm下讀取瞬時吸光度A0。于10 min后用移液槍在瓶底取20 μL加入至5 mL的0.1% SDS溶液中，讀取吸光度A10。乳化活性及乳化穩(wěn)定性按式（1）、（2）計算：

式中：A0為0 min吸光度；A10為10 min吸光度；N為稀釋倍數(shù)；θ為油脂占總數(shù)的比例；l為光路長度/cm；c為蛋白質量濃度/（g/mL）；ΔT為間隔時間/min。

1.3.6 黏度的測定

取適量乳液加入至流變儀測量筒中，選用SC4-18型轉子，于轉速50 r/min下測定乳液的黏度，測試結果由Rheocalc軟件采集。

1.3.7 蛋白質界面吸附率的測定

參照Qin Xinsheng等[14]的測定方法并稍作修改。取20 mL乳液4 000 r/min離心10 min，輕輕吸取下清液并通過凱氏定氮法測定其蛋白含量，按式（3）計算乳液的界面吸附率：

式中：C0為乳液總蛋白質量濃度/（g/mL）；Cf為下清液蛋白質量濃度/（g/mL）。

1.3.8 粒徑的測定

采用激光粒度儀進行測定。分散介質為水，微粒的折射率設置為1.59，采用體積平均直徑d（4,3）表征乳液液滴粒度的大小。

1.3.9 Zeta電位的測定

將乳液用去離子水稀釋250 倍之后由粒度電位儀測定。移取0.10 mg/mL樣品于密封容器中，上樣體積1 mL，測定過程中設折光系數(shù)為1.450，25 ℃保溫平衡2 min。實驗結果取3 次平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復測定3 次。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，平均數(shù)間比較釆用Duncan模型檢驗法，P＜0.05，差異顯著。釆用Origin 9.1軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 乳液微觀結構表征

2.1.1 乳液光學顯微鏡鏡觀察

如圖1所示，2 種乳液液滴均呈圓球形，且大小較為均勻。O/W乳液中，蛋白質和PGPR 90在水油界面形成了一層致密的保護膜，乳液內部油相分布均勻，且當米糠蛋白質量濃度大于1.0 g/100 mL時，乳液的粒徑相對較大。在放大同樣倍數(shù)的情況下，W/O/W乳液的鏡下微觀狀態(tài)形成了圖像所表征的“乳液當中含有小液滴”的W/O/W形態(tài)，乳液內部各個液滴大小不一，W/O/W液滴直徑明顯大于O/W乳液，這是因為雙層乳液經過兩步攪打體系中層級復雜造成的，此結果也與乳液粒徑的測試結果趨勢一致。當米糠蛋白質量濃度在0.5 g/100 mL以下時，乳液內部的初乳W/O液滴大小不一，可能是由于內水相蛋白質量濃度較低導致內部發(fā)生了架橋絮凝現(xiàn)象[15]；蛋白質量濃度為0.5 g/100 mL時，W/O/W乳液內部液滴較多且相對均勻；蛋白質量濃度在1.0～1.5 g/100 mL之間時，乳液內部的初乳W/O液滴較少且其粒徑較小，PGPR 90在最外層的水油界面上形成了致密保護層，乳液與外界分隔明顯；當?shù)鞍踪|量濃度大于2.0 g/100 mL時，乳液內部W/O液滴不斷絮凝，部分大粒徑的液滴逐漸向外部移動，且有破乳的趨勢，這可能是因為蛋白質過量引發(fā)了界面競爭從而造成界面紊亂[16]。

圖1 米糠蛋白O/W及W/O/W乳液的光學顯微鏡圖Fig.1 Optical microscopic images of rice bran protein-stabilized O/W and W/O/W emulsions

2.1.2 激光共聚焦顯微鏡圖像

如圖2所示，米糠蛋白質量濃度為0.4 g/100 mL時，2 種形態(tài)的乳液均在不同熒光下發(fā)出明顯熒光信號。O/W乳液中，油滴呈綠色圓球狀，蛋白質呈紅色顆粒分布在連續(xù)相中。這說明當O/W乳液蛋白質量濃度為0.4 g/100 mL時存在著一定的顆粒游離現(xiàn)象。在W/O/W乳液中，呈綠色的油相和呈紅色的蛋白質均勻且交替分布在乳液內部，蛋白質大部分在液滴內部的水-油界面起到穩(wěn)定作用，形成空間位阻，防止了W/O液滴之間的聚集作用[17]。與蛋白質大量游離在體系中的O/W乳液相比，W/O/W乳液體系中游離蛋白質顆粒明顯較少，蛋白質利用率高，這也證實了將蛋白質置于內水相的雙乳化法制備的W/O/W乳液可以更好地發(fā)揮米糠蛋白的界面性質，在內相W/O液滴中起到穩(wěn)定的作用。

圖2 米糠蛋白O/W（A）及W/O/W（B）乳液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.2 CLSM images of rice bran protein-stabilized O/W (A) and W/O/W (B) emulsions

2.2 米糠蛋白質量濃度對O/W及W/O/W乳液表觀穩(wěn)定性的影響

將不同質量濃度的米糠蛋白制備的O/W乳液和W/O/W乳液分別于制備結束當時（0 h）、放置24 h和放置48 h的圖像記錄。由圖3可知，在0 h，各實驗組均呈乳白色，無析出現(xiàn)象，液體有類似牛奶的流動特性。隨著時間的延長，2 種乳液均有不同程度的分層現(xiàn)象。24 h后，O/W乳液出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象，且質量濃度越高，析出的液體顏色越深。部分W/O/W乳液也開始出現(xiàn)析出現(xiàn)象，但總體明顯比O/W乳液穩(wěn)定，且質量濃度越高，與O/W乳液的差異越明顯；W/O/W乳液析出的水相顏色較淺，含有蛋白顆粒較少，這也進一步證實同樣條件下W/O/W乳液的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于O/W乳液。48 h后，W/O/W乳液均出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，但其乳析指數(shù)的大小與米糠蛋白質量濃度并不具有相關性，這可能是蛋白質在界面上發(fā)生重組和排列，或者是發(fā)生了界面競爭的現(xiàn)象導致。

圖3 米糠蛋白O/W及W/O/W乳液的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of rice bran protein-stabilized O/W and W/O/W emulsions

2.3 質量濃度對米糠蛋白乳化活性及乳液穩(wěn)定性的影響

由圖4A可知，相同質量濃度下，雙乳化法制備的W/O/W型米糠蛋白乳化體系中，蛋白質的乳化活性均高于O/W乳液。這表明，雙乳化法可以有效激發(fā)米糠蛋白顆粒在界面上吸附水相和油相進而形成乳液的能力。同時，隨著米糠蛋白質量濃度逐漸升高，乳化活性均呈逐漸下降趨勢，推測是因為界面上的米糠蛋白過量，體系混亂導致的界面張力升高，進而影響了乳液的穩(wěn)定性[18-19]。

由圖4B可知，隨著蛋白質量濃度的增加，O/W乳液體系中，米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性逐漸下降，這可能是大豆油中添加的親脂性乳化劑PGPR 90與米糠蛋白在O/W界面上發(fā)生了競爭，乳化劑超量導致多余的蛋白質顆粒游離在連續(xù)相中，加劇了蛋白的團聚程度，蛋白質之間的吸附力超過了界面吸附力，導致液滴破乳[20]。W/O/W乳液中，蛋白質的乳化穩(wěn)定性先上升后下降，在米糠蛋白質量濃度為0.4 g/100 mL時達到最高?？赡苁敲卓返鞍踪|量濃度為0.3 g/100 mL時，用于穩(wěn)定界面的顆粒數(shù)量不足，導致了蛋白質的共用現(xiàn)象，液滴之間聚合[21]，而質量濃度大于0.5 g/100 mL時，界面上的顆粒較多，W/O/W乳液體系相對混亂導致了米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性下降。但當米糠蛋白質量濃度為0.5 g/100 mL及以上時，W/O/W乳液與O/W乳液中米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性幾乎無明顯差異，這與圖3表觀圖像觀察到的乳液的穩(wěn)定程度不同。推測這可能是貯存過程中蛋白質在界面上發(fā)生吸附和重排導致。

圖4 不同質量濃度米糠蛋白的乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig.4 EAI (A) and ESI (B) of emulsions stabilized with different concentrations of rice bran protein

2.4 米糠蛋白質量濃度對O/W及W/O/W乳液黏度的影響

由圖5可知，O/W乳液的黏度基本維持在10 mPa?s以下，其黏度較低、質地偏稀，乳液的流動性大，易產生油滴沉降現(xiàn)象，從而導致乳液失穩(wěn)；W/O/W乳液的黏度呈先上升再下降的趨勢。在米糠蛋白質量濃度為1.5 g/100 mL之前，隨著米糠蛋白溶液的增多，W/O/W乳液的黏度逐漸升高，這可能是蛋白質顆粒逐漸增多，在界面發(fā)揮的穩(wěn)定作用越強，減緩了乳液的絮凝現(xiàn)象[22]。在米糠蛋白質量濃度為2.0 g/100 mL時，乳液的黏度最高，可能是多余的蛋白質顆粒游離在連續(xù)相中，增大了連續(xù)相的黏稠性[23]；當質量濃度為2.5 g/100 mL時，乳液的黏度開始變小，這可能是因為界面中蛋白質含量過于飽和，多余的顆粒游離在連續(xù)相中與界面上的顆粒發(fā)生競爭，導致體系混亂破乳，液滴各相之間開始趨于分離，黏度開始降低[24]。

圖5 米糠蛋白O/W及W/O/W乳液的黏度Fig.5 Viscosity of rice bran protein-stabilized O/W and W/O/W emulsions

2.5 米糠蛋白質量濃度對O/W及W/O/W乳液界面吸附率的影響

蛋白質作為兩親性的穩(wěn)定劑，其在水-油界面的吸附率也對乳液的穩(wěn)定性起到關鍵作用。吸附在界面上的蛋白顆?？梢杂行У卦诮缑嫔闲纬梢粚又旅艿姆指魧?，在油水兩相之間形成空間位阻，阻止了液滴的破乳和絮凝現(xiàn)象，但過多的顆粒可能會引起蛋白質在界面上因張力過大引發(fā)的競爭或交聯(lián)現(xiàn)象，加大了破乳的可能。由圖6可知，雙乳化法制備的W/O/W乳液的顆粒吸附率均高于O/W乳液，這是因為將蛋白質置于W/O/W乳液的內水相可以更好地激發(fā)蛋白質顆粒的穩(wěn)定能力，在W/O/W乳液內部起到穩(wěn)定劑的作用。當米糠蛋白質量濃度不小于0.4 g/100 mL時，W/O/W乳液中蛋白質的界面吸附率高達78%以上。在米糠蛋白質量濃度為0.3 g/100 mL時，蛋白質顆粒在界面的吸附量明顯低于其他質量濃度，這可能是因為蛋白質量濃度過低導致的液滴在界面短暫穩(wěn)定后發(fā)生了游離現(xiàn)象。

圖6 米糠蛋白O/W及W/O/W乳液的吸附率Fig.6 Proportion of adsorbed protein in rice bran protein-stabilized O/W and W/O/W emulsions

2.6 米糠蛋白質量濃度對O/W及W/O/W乳液粒徑和電位的影響

由表1可知，相同質量濃度下，W/O/W乳液的液滴的粒徑均大于O/W乳液，這與光學顯微鏡的拍攝結果一致。可能是由于W/O/W乳液經過2 次乳化，液滴中包裹小液滴的結構導致粒徑較大[25]；也可能有少部分乳液液滴破乳聚集形成的[26]；其形態(tài)如圖7所示。W/O/W乳液的粒徑隨著米糠蛋白質量濃度的上升先增大后減小，當?shù)鞍踪|量濃度為0.4 g/100 mL時，乳液內部包裹了更多的W/O液滴，粒徑較大；米糠蛋白質量濃度為0.5 g/100 mL以上時，乳液的粒徑基本維持在30～40 μm之間，可能是在體系中米糠蛋白在界面發(fā)生重排進而穩(wěn)定了水油兩相；沒有多余蛋白質進入連續(xù)相導致的體系失穩(wěn)，也避免了由于蛋白質量濃度不足導致的液滴短暫穩(wěn)定后的絮凝現(xiàn)象[27-28]。

圖7 O/W乳液（A）及W/O/W乳液（B）的形態(tài)示意圖Fig.7 Morphology diagrams of O/W emulsion (A) and W/O/W emulsion (B)

表1 不同米糠蛋白質量濃度乳液的粒徑和電位Table 1 Particle sizes and zeta potentials of emulsions stabilized with different concentrations of rice bran protein

同時，W/O/W乳液的電位值也隨質量濃度的升高呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢。O/W乳液很難借助靜電斥力達到穩(wěn)定乳液的目的，而除0.3 g/100 mL組外，其他質量濃度W/O/W乳液均能夠借助靜電斥力達到穩(wěn)定乳液的目的[29]。米糠蛋白質量濃度為0.4 g/100 mL時，W/O/W乳液的電位絕對值達到最大，乳液液滴之間的靜電排斥作用越強，有效地防止了液滴之間的聚集，對乳液的穩(wěn)定有積極作用[30-31]。

3 結 論

本研究方法可有效制備O/W及W/O/W乳液，且W/O/W乳液的穩(wěn)定性顯著高于O/W乳液。貯存48 h后，O/W乳液大量析出，且隨著蛋白質量濃度的升高析出液體顏色越深；W/O/W乳液析出液體明顯較少，且顏色較淺，這是因為W/O/W乳液的界面蛋白質吸附率普遍高于O/W乳液且當米糠蛋白質量濃度不小于0.4 g/100 mL時，W/O/W乳液中蛋白質的界面吸附率高達78%以上。O/W乳液的穩(wěn)定指數(shù)隨著米糠蛋白質量濃度的上升逐漸降低，黏度均小于10 mPa?s；W/O/W乳液的穩(wěn)定指數(shù)、黏度均顯著高于O/W乳液；當?shù)鞍踪|量濃度為2.0 g/100 mL時，W/O/W乳液的黏度高達42 mPa?s，相當于等量蛋白質O/W乳液的4 倍。這些數(shù)據(jù)表明了W/O/W乳液顆粒利用率高，體系黏度大，油相不易沉降，有更好的乳化能力和穩(wěn)定性。當米糠蛋白質量濃度為0.4 g/100 mL時，W/O/W乳液的穩(wěn)定性較O/W乳液提高了1 倍以上，此時液滴間的靜電斥力最強，絕對值達到84左右，這是造成此乳液更加穩(wěn)定的主要因素。本研究為天然米糠蛋白質在食品級乳液中的開發(fā)提供參考，為糧食副產物的綜合利用提供了新思路。