防己諾林堿通過Nrf2/NLRP3途徑對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨結(jié)構(gòu)和成骨細(xì)胞凋亡的影響

左遠(yuǎn)勝，何智圣，付中明，李名武，孫法瑞，周 強

0 引言

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種全身性骨病，主要特征是骨密度降低、骨量減少、骨組織的微結(jié)構(gòu)退化，具有骨折的趨勢[1-2]。OP由多種因素引起，如衰老、遺傳和雌激素缺乏[3]。更年期婦女可能由于卵巢功能低下而導(dǎo)致雌激素缺乏癥，從而誘發(fā)OP，這將導(dǎo)致骨質(zhì)流失和骨骼脆弱，甚至在嚴(yán)重的情況下還會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折[4]。因此，由雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松的研究引起了廣泛的關(guān)注。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)在OP中起重要作用[5-6]。研究表明，Nrf2是骨細(xì)胞中骨平衡的重要調(diào)節(jié)劑，其激活可以增強內(nèi)源性抗氧化劑對活性氧的抑制作用，從而調(diào)節(jié)OP的發(fā)生[7]。Nrf2通過誘導(dǎo)抗氧化劑和II期解毒酶，在細(xì)胞的壽命中對細(xì)胞防御抗氧化劑和氧化應(yīng)激起著重要作用[8]。此外，Nrf2下調(diào)了NLRP3介導(dǎo)的炎癥過程和先天性免疫反應(yīng)[9]。但是，Nrf2/NLRP3途徑對體內(nèi)骨結(jié)構(gòu)的影響及其在OP中的可能作用尚未完全了解。防己諾林堿(Fangchinoline,FAN)是一種生物堿，具有抗炎活性[10]。防己諾林堿可減弱TNF-α、IL-6和IL-1的產(chǎn)生，并抑制環(huán)氧合酶的活性[11]。防己諾林堿還具有較強的自由基清除、降壓、抗癌、抗氧化和抗血栓形成活性[12-13]。但是，防己諾林堿在去卵巢OP中研究甚少。本文嘗試研究防己諾林堿是否對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨結(jié)構(gòu)和成骨細(xì)胞凋亡有影響，其作用機制是否與Nrf2/NLRP途徑有關(guān)，為臨床治療OP提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只成年雌性SD大鼠(SPF級，200～220 g)購自華中科技大學(xué)實驗動物中心。實驗大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房中，正常飲食飲水。大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后進行實驗。

1.1.2 試劑 防己諾林堿購自美國Sigma公司。大鼠血清ALP試劑盒和大鼠OC試劑盒購自杭州誠維生物公司。大鼠IL-6試劑盒和大鼠血清TNF-α試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。HE試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。TUNEL分析試劑盒購自美國Promega公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國Promega公司。兔抗Nrf2抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢OP大鼠模型制備 大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉條件下打開大鼠腹腔去除雙側(cè)卵巢，逐層縫合。假手術(shù)組僅打開腹腔，不切除卵巢。

1.2.2 分組及給藥 SD大鼠分為4組：假手術(shù)組(sham組)、OP組、防己諾林堿低劑量組(OP+FAN-L組)和防己諾林堿高劑量組(OP+FAN-H組)，每組15只。OP組、OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠按”1.2.1”項進行OP模型制作。

給藥方式：腹腔注射；給藥時間：造模后1周，連續(xù)給藥4周；給藥次數(shù)：1次/d。Sham組：生理鹽水4 ml/kg；OP組：生理鹽水4 ml/kg；OP+FAN-L組：1 mg/kg防己諾林堿，給藥體積為4 ml/kg；OP+FAN-H組：3 mg/kg防己諾林堿，給藥體積為4 ml/kg。

1.2.3 微型計算機斷層掃描(μCT) 將大鼠脛骨固定在70%的乙醇中，使用Scanco μCT-35儀器進行μCT以評估骨體積和結(jié)構(gòu)。使用Scanco軟件計算骨小梁參數(shù)(包括BV/TV、Tb.Th和Tb.Sp)，以分析直接位于脛骨近端生長板遠(yuǎn)端的小梁區(qū)域。

1.2.4 ELISA ①ALP和OC水平測定：實驗結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動脈取血，并置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測定各孔的OD值，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中ALP和OC的表達水平。②IL-6和TNF-α水平測定：將各組大鼠骨組織放入到9倍體積的PBS中，用勻漿器分散到勻漿中，在4 ℃以3 000 r/min離心15 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測定各孔的OD值，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出骨組織中IL-6和TNF-α的表達。

1.2.5 HE染色 各組大鼠股骨在10% NBF中固定，并在10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣3周，包埋在石蠟中，制成5 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精中脫水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，各5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進行拍攝。

1.2.6 TUNEL 石蠟切片固定，漂洗并用0.1% Triton X-100浸潤，然后使用TUNEL分析試劑盒對凋亡的DNA片段進行FITC末端標(biāo)記。熒光顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的TUNEL陽性細(xì)胞并拍照。

1.2.7 Western blot 各組大鼠骨組織用RIPA裂解提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過夜：兔抗Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗NLRP3抗體(1∶1 000)、和兔抗GAPDH抗體(1∶2 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 防己諾林堿對OP大鼠骨組織的影響 μCT結(jié)果表明，與sham組相比，OP組大鼠的BV/TV和Tb.Th指數(shù)顯著下降(P<0.01)，Tb.Sp指數(shù)顯著上升(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠的BV/TV和Tb.Th指數(shù)顯著上升(P<0.05)，Tb.Sp指數(shù)顯著下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織μCT圖像和μCT圖像計算的骨參數(shù)注：與sham組比較，**P<0.001；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 防己諾林堿對OP大鼠血清中ALP和OC表達水平的影響 ELISA結(jié)果表明，與sham組相比，OP組大鼠血清中ALP的表達水平顯著上調(diào)，OC的表達水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠血清中ALP的表達水平下調(diào)，OC的表達水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠血清中ALP和OC的表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3 防己諾林堿對OP大鼠骨組織中IL-6和TNF-α表達水平的影響 ELISA結(jié)果表明，與sham組相比，OP組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α的表達水平上調(diào)(P<0.01)；與OP組比較，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α的表達水平下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠骨組織中IL-6和TNF-α表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.4 防己諾林堿對OP大鼠骨組織病理損傷的影響 HE染色結(jié)果表明，與sham組比較，OP組大鼠骨組織中骨小梁面積顯著減少(P<0.01)；與OP組比較，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中骨小梁面積有所增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠骨組織中骨小梁面積變化注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.5 防己諾林堿對OP大鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果表明，sham組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量很少；與sham組相比，OP組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量變化注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.6 防己諾林堿對OP大鼠骨組織中Nrf2和NLRP3蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果表明，與sham組相比，OP組大鼠骨組織中Nrf2蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)，NLRP3蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與OP組相比，OP+FAN-L組和OP+FAN-H組大鼠骨組織中Nrf2蛋白表達水平上調(diào)(P<0.05)，NLRP3蛋白表達水平下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠骨組織中Nrf2和NLRP3蛋白的表達水平注：與sham組比較，**P<0.01；與OP組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

骨質(zhì)疏松癥全骨量和骨密度下降，并且骨組織微結(jié)構(gòu)的退化導(dǎo)致骨強度降低和骨脆性增加，并伴有病理性骨折[14-16]。其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種因素，如骨骼重塑障礙、抑制性免疫功能障礙、抑制骨分化、維生素D缺乏癥和激素調(diào)節(jié)。目前的研究表明，在骨重塑的生理過程中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞維持了骨吸收與骨形成之間的平衡[17-18]。成骨細(xì)胞移動到吸收位點并分泌骨基質(zhì)，礦化并形成新的骨骼。破骨細(xì)胞可以在多個部位吸收和降解骨基質(zhì)，而成骨細(xì)胞在吸收部位分化為新的骨組織。OP的發(fā)生是由于骨骼吸收大于骨骼形成。然而，在骨形成和骨吸收過程中特定的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，涉及的基因，調(diào)控方式和其他生物學(xué)機制等尚不明確。

防己諾林堿是一種生物堿，具有抗氧化、抗炎和細(xì)胞毒性作用以及抗癌活性[19]。Jiang等[20]研究報道，防己諾林堿可抑制糖尿病大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激。本研究顯示，OP組大鼠血清ALP含量顯著升高，OC含量顯著降低，IL-6和TNF-α的含量也顯著升高，而防己諾林堿使ALP含量降低，OC含量升高，IL-6和TNF-α的含量也降低。上述結(jié)果表明，防己諾林堿可以通過影響血清ALP、OC和炎癥因子來治療OP。

綜上所述，防己諾林堿減少炎癥因子的表達和成骨細(xì)胞凋亡，增加骨組織中骨小梁面積和Nrf2的表達水平，抑制NLRP3的表達，從而治療OP。因此，可將防己諾林堿作為治療OP的可選藥物，為臨床上治療OP提供新的理論依據(jù)。