ARHI通過Wnt/自噬通路調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的研究

李建豪，呂少華，李吉辰，樸松林

0 引言

口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤[1]，約占全球人類癌癥總數(shù)的1%～3%，在口、咽惡性腫瘤中約占90%，且發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)[2]。OSCC中以舌鱗癌最多見，后者惡性程度高，嚴(yán)重威脅人類健康[3]。在過去的30年內(nèi)，盡管早期診斷、誘導(dǎo)化療、功能性手術(shù)及輔助放療等對(duì)OSCC的治療取得了長足的進(jìn)步,但OSCC患者的5年生存率仍然維持在50.0%～55.0%[3-4]。因此，新的OSCC診斷標(biāo)志物以及預(yù)后相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)尤為重要。

自噬是真核細(xì)胞主要的降解途徑之一，屬于程序性細(xì)胞死亡[5]。大量研究表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-9]。

Aplasia-Ras同源物成員I(Aplasia ras homolog I,ARHI)又稱DIRAS3，是與Ras相關(guān)的母體印跡腫瘤抑制基因，已有研究表明，ARHI在膠質(zhì)瘤[10]、卵巢癌[11]、乳腺癌[12]以及OSCC[13]中低表達(dá)，但ARHI對(duì)OSCC生物學(xué)活性的作用以及潛在的作用機(jī)制有待研究。

本研究通過生物信息學(xué)、免疫組織化學(xué)、Western blot等方法，探討ARHI在OSCC中的表達(dá)情況，驗(yàn)證ARHI能否通過Wnt信號(hào)通路調(diào)控OSCC細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)自噬，從而為OSCC的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 所有材料均選自2016-2019年于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院行OSCC根治術(shù)的20例OSCC石蠟組織標(biāo)本，并收集20例癌旁健康組織作為對(duì)照。鱗癌組織標(biāo)本中男性10例，女性10例；高分化10例，中分化5例，低分化5例。患者年齡30～72歲，平均(48.0±8.5)歲。所有患者均未接受過術(shù)前放療或化療，且排除其他部位患有原發(fā)性癌癥。所有材料均符合哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定，患者均簽署知情同意書。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 數(shù)據(jù)來源 使用的OSCC數(shù)據(jù)集從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因表達(dá)綜合總線(GEO)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載。原始基因表達(dá)譜從GSE9844和GSE75540數(shù)據(jù)集獲得。使用R包affy和Annotate處理原始數(shù)據(jù)，制作表達(dá)矩陣并使探針與它們的基因符號(hào)匹配，R包sva用于組合和校正兩個(gè)數(shù)據(jù)集。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫篩選ARHI在頭頸部鱗癌中的表達(dá)。

1.2.2 差異基因的篩選 如果存在重復(fù)的基因，則采用平均值。隨后使用微陣列數(shù)據(jù)線性模型(LIMMA)封裝來篩選OSCC樣品和對(duì)照樣品之間的DEG。調(diào)整后的P值<0 .01和|對(duì)數(shù)倍數(shù)變化(FC)| > 1/2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 共表達(dá)基因和富集分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫查找ARHI的共表達(dá)基因。隨后，使用Metascape數(shù)據(jù)庫富集ARHI的共表達(dá)基因。

1.3 所需試劑 ARHI過表達(dá)質(zhì)粒(銳博生物，中國)，ARHI、β-catenin、GSK-3β、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin-1以及β-actin(CST，美國)，吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)(Solarbio Biotechnology，中國)，mRFP-GFP-LC3腺病毒(漢恒生物，中國)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ARHI過表達(dá)質(zhì)粒購自銳博生物有限公司，使用專用的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染ARHI 48 h后，檢測(cè)不同過表達(dá)質(zhì)粒的ARHI蛋白表達(dá)。

1.5 免疫組化分析 所有標(biāo)本均用10%中性甲醛溶液浸泡固定，常規(guī)脫水后用石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，每5張去1張。進(jìn)行免疫組化染色，ARHI抗原均采用免疫組化DAB 染色法，嚴(yán)格按照兔抗人ARHI單克隆抗體試劑盒說明書進(jìn)行。然后使用DAB進(jìn)行顯色。經(jīng)自來水洗滌、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲基苯透明后，將切片用樹脂固定，置顯微鏡下觀察。石蠟切片由我院2名病理學(xué)家在未知腫瘤級(jí)別的情況下進(jìn)行雙盲閱片。

1.6 Western blot分析 Western blot分析檢測(cè)過表達(dá)ARHI后，CAL-27和SCC-115細(xì)胞中凋亡以及自噬相關(guān)蛋白的變化。將含有蛋白酶抑制劑以及細(xì)胞裂解液(1∶50)加入轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中，通過BCA(碧云天，中國)檢測(cè)蛋白濃度。在80 V電壓下恒壓電泳1.5 h后，200 mA恒流轉(zhuǎn)印2 h，之后在5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后將轉(zhuǎn)印好的硝酸纖維素膜與相應(yīng)的一抗(β-catenin、GSK-3β、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin-1以及β-actin)在相宜的濃度下進(jìn)行結(jié)合，然后置于4 ℃搖床中孵育過夜。清洗硝酸纖維素膜后，用陽離子化辣根過氧化物酶(CHRP)結(jié)合二級(jí)抗體(山羊抗兔1∶2 000，中國中山金橋)孵育1 h。然后在紫外光下顯影，用圖像分析系統(tǒng)檢查。

1.7 吖啶橙/溴化乙錠熒光染色 分別將過表達(dá)ARHI以及其對(duì)照轉(zhuǎn)染于CAL-27和SCC-115細(xì)胞中48 h。隨后將細(xì)胞與吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)(Solarbio biotechnology，China)按1∶1的比例培養(yǎng)5 min。采用以下公式計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比：凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞自噬 將過表達(dá)ARHI以及ARHI對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染到CAL-27和SCC-115細(xì)胞中，然后感染mRFP-GFP-LC3腺病毒。12 h后更換培養(yǎng)基，24 h后采集熒光圖像。GFP和mRFP熒光共定位，表明一個(gè)小室沒有與溶酶體融合；沒有GFP的mRFP信號(hào)表明一個(gè)小室已經(jīng)與溶酶體融合。

2 結(jié)果

2.1 ARHI基因在頭頸部鱗癌中的表達(dá) 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫，頭頸部鱗癌患者組織的ARHI mRNA表達(dá)譜結(jié)果顯示，與健康樣本相比，ARHI在頭頸部鱗癌患者中表達(dá)降低(P=0.038)(圖1A)。UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測(cè)頭頸部鱗癌患者不同亞組分析數(shù)據(jù)集，證明頭頸部鱗癌患者組織與正常樣本相比，ARHI的表達(dá)明顯降低(圖1B)。在頭頸部鱗癌患者中，不同病理學(xué)分級(jí)、年齡、種族以及腫瘤分期的ARHI基因具有差異表達(dá)(圖1C-1F)。不同人種中不同ARHI表達(dá)水平的頭頸部鱗癌患者的生存時(shí)間也不相同(P=0.047，圖2)，這些結(jié)果表明，ARHI參與了頭頸部鱗癌的惡性進(jìn)展，影響患者生存。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫比較不同人種、不同ARHI表達(dá)水平的頭頸部鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 ARHI基因在OSCC中低表達(dá) 利用整合表達(dá)譜(GSE9844和GSE75540)對(duì)OSCC癌和癌旁組織進(jìn)行比較，篩選出68個(gè)差異基因。通過在P值和FC之間繪制DEG來構(gòu)造“火山圖”。芯片圖中顯示了差異基因表達(dá)的熱圖。結(jié)果顯示，ARHI基因表達(dá)降低(圖3A)。同時(shí)，與癌旁組織相比，OSCC癌組織中的ARHI基因表達(dá)顯著降低(P=0.027，圖3B)。20例免疫組化結(jié)果顯示，ARHI在OSCC中表達(dá)降低(P=0.035，圖3C)。

圖3 ARHI在OSCC組織中的表達(dá)注：A.整合GSE75540以及GSE9844芯片數(shù)據(jù)后的熱圖；B.ARHI在OSCC中的mRNA表達(dá)；C.ARHI在OSCC患者組織中蛋白表達(dá)(免疫組化)。*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 過表達(dá)ARHI抑制OSCC細(xì)胞增殖活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 過表達(dá)ARIⅡ后，在CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中ARHI明顯升高(P=0.042，圖4A)細(xì)胞增殖活性明顯降低(P=0.035，圖4B)，而空質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖活性相對(duì)于正常組沒有任何改變(P=0.083，圖4B)。相對(duì)于正常對(duì)照組，過表達(dá)ARHI組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P=0.027，圖4C)。過表達(dá)ARHI能夠明顯使Bax蛋白升高(P=0.035，圖4D)，同時(shí)Cleaved-caspae-3/Caspae-3的表達(dá)也升高(P=0.029，圖4D)。以上結(jié)果表明，OSCC細(xì)胞中過表達(dá)ARHI能夠抑制細(xì)胞增殖活性，誘導(dǎo)凋亡。

圖4 過表達(dá)ARHI對(duì)于口腔鱗癌細(xì)胞增殖活性的影響注：A.Western blot 檢測(cè)過表達(dá)ARHI后CAL-27、SCC-115細(xì)胞中ARHI蛋白的表達(dá)；B.CCK-8檢測(cè)過表達(dá)ARHI后CAL-27、SCC-115細(xì)胞的增殖活性變化；C.AO/EB檢測(cè)過表達(dá)ARHI后，CAL-27以及SCC-115細(xì)胞凋亡的變化；D.過表達(dá)ARHI后CAL-27、SCC-115細(xì)胞中Bax蛋白及 Cleaved-caspase-3/Caspase-3的表達(dá)。*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.4 OSCC細(xì)胞中過表達(dá)ARHI對(duì)于Wnt信號(hào)通路的影響 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中找到了200個(gè)ARHI共表達(dá)基因，使用Metascape進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些途徑主要集中在葉酸生物合成、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、小分子轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯后蛋白磷酸化(圖5A)。而Wnt 信號(hào)通路是參與OSCC惡性進(jìn)展的經(jīng)典通路之一。為了進(jìn)一步探討Wnt 信號(hào)通路在ARHI參與OSCC惡性進(jìn)展中的作用，我們檢測(cè)了過表達(dá)ARHI后Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典蛋白GSK-3β以及β-catenin的變化，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ARHI后，GSK-3β的蛋白表達(dá)上調(diào)(P=0.035，圖5 B)，且β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(P=0.031，圖5 C)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)ARHI后能夠調(diào)控Wnt 信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡。

圖5 過表達(dá)ARHI對(duì)CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的影響注：A.ARHI在OSCC中可能的作用通路；B.過表達(dá)ARHI后CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中GSK-3β蛋白的變化；C.過表達(dá)ARHI后CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中β-catenin蛋白的變化。*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.5 OSCC細(xì)胞中過表達(dá)ARHI促進(jìn)細(xì)胞自噬 為了進(jìn)一步確定過表達(dá)ARHI誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡的途經(jīng)，我們通過透射電鏡檢測(cè)了CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中自噬小體的變化。結(jié)果顯示，相對(duì)于正常組，過表達(dá)ARHI后，CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中自噬小體數(shù)量明顯增多(P=0.043，圖6A)。采用免疫熒光法檢測(cè)LC3在過表達(dá)ARHI后的變化，結(jié)果顯示，相對(duì)于正常對(duì)照組，LC3表達(dá)明顯增多(P=0.044，圖6B)。隨后，通過Western blot方法檢測(cè)CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果顯示，過表達(dá)ARHI后，能夠使Beclin-1及LC3II/I表達(dá)升高(P=0.031，P=0.042，圖6C)。以上結(jié)果表明，自噬參與了過表達(dá)ARHI誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡。

圖6 過表達(dá)ARHI對(duì)CAL-27、SCC-115細(xì)胞中自噬相關(guān)因子的影響注：A.透射電鏡顯示自噬小體；B.免疫熒光顯示LC3表達(dá)；C.自噬相關(guān)蛋白LC3II/I以及Beclin-1的表達(dá)

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ARHI在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[13]。然而，ARHI在OSCC中的作用尚未明確。本研究首先通過GEPIA以及UALCAN數(shù)據(jù)庫證明了ARHI在頭頸部鱗癌中低表達(dá)，同時(shí)，通過整合GEO芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ARHI在OSCC中低表達(dá)，且免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證明了ARHI在OSCC中低表達(dá)。通過分子生物學(xué)方法，過表達(dá)ARHI能夠調(diào)控Wnt信號(hào)通路經(jīng)典蛋白，進(jìn)而使細(xì)胞自噬增加，誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡，提示ARHI可能是治療OSCC的新靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡和自噬是兩個(gè)重要的過程，在生理和病理上維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，兩條通路之間可能發(fā)生串?dāng)_。以往的研究表明，細(xì)胞的自噬可以通過消除潛在毒性大分子和受損細(xì)胞器進(jìn)而參與細(xì)胞活性的調(diào)控[14]。此外，一些自噬與OSCC的研究發(fā)現(xiàn)，OSCC細(xì)胞自噬能夠誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[8-9,15]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ARHI在OSCC組織中低表達(dá)，且影響OSCC患者的生存期。而細(xì)胞凋亡與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)[16]。隨后我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)ARHI后，在CAL-27以及SCC-115細(xì)胞中觀察到自噬現(xiàn)象，包括自噬小體增多、LC3II/I的表達(dá)升高、Beclin-1的表達(dá)水平增加。本研究的結(jié)果表明，過表達(dá)ARHI可能通過促進(jìn)OSCC細(xì)胞自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此前，Wei等[17]曾報(bào)道Genipin通過PI3K/AKT/mTOR途徑誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞生長。同時(shí)，Chen等[18]證明Erianin誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡和自噬。這也進(jìn)一步印證了我們之前的結(jié)果。因此，ARHI在癌細(xì)胞的生物學(xué)功能依賴細(xì)胞自噬。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，ARHI在OSCC中是通過促進(jìn)OSCC細(xì)胞自噬，進(jìn)而發(fā)揮多種生物學(xué)功能的。

Wnt信號(hào)通路在OSCC的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[19]，并且參與調(diào)控細(xì)胞自噬[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)ARHI后，能夠使細(xì)胞自噬增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，ARHI促進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)ARHI后，Wnt信號(hào)通路中經(jīng)典蛋白β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，且GSK-3β蛋白表達(dá)上調(diào)，說明Wnt信號(hào)通路在ARHI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)被調(diào)控。這一結(jié)果與Li等[21]的報(bào)道相一致：LRP6通過Wnt/β-catenin途徑調(diào)節(jié)Rab7介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明，ARHI通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而影響細(xì)胞自噬，參與過表達(dá)ARHI后OSCC細(xì)胞凋亡。本研究雖然證明了Wnt信號(hào)通路參與了ARHI誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞凋亡，然而，其作用機(jī)制尚不明確，有待開展后續(xù)研究。

綜上，本研究表明，ARHI可能作為口腔鱗癌細(xì)胞的抑癌基因，通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白，進(jìn)而加速細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而過表達(dá)ARHI基因抑制了細(xì)胞的增殖活性，并提高了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。在未來的研究中，我們將著重研究ARHI在OSCC侵襲遷移以及動(dòng)物模型中的作用，為ARHI在OSCC中的作用提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。