腸道微生物與腸上皮細(xì)胞互作關(guān)系的研究進(jìn)展

林玥瑩，王敏奇

（浙江大學(xué)教育部動物分子營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

腸道不僅是動物消化吸收的主要器官，也是機(jī)體最大的免疫器官。腸道穩(wěn)態(tài)依賴于腸腔中的微生物、腸上皮細(xì)胞以及腸道免疫細(xì)胞三者的互作。腸道微生物群是腸道微生態(tài)的重要組成部分，由細(xì)菌、真菌、病毒等組成，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收以及抵抗病原體入侵等方面具有重要作用。腸道上皮細(xì)胞可以接收來自營養(yǎng)物質(zhì)、共生細(xì)菌及病毒等的相關(guān)信號，調(diào)節(jié)腸腔中的微生物與固有層免疫細(xì)胞之間的互作，從而維持腸道健康[1]。近年來，腸道微生物與腸上皮細(xì)胞之間的互作已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。大量研究指出，早期腸道微生物定植是一個(gè)動態(tài)變化的過程，除各微生物群之間的相互作用，同時(shí)也會受到飲食、母體及環(huán)境等因素影響，最終形成穩(wěn)定的微生態(tài)區(qū)系。同時(shí)，腸上皮細(xì)胞是腸黏膜物理和化學(xué)屏障的重要組成部分，在其抵御病原微生物入侵時(shí)，腸道共生菌可通過TLRs 信號途徑，輔助腸上皮細(xì)胞保持對病原微生物的免疫反應(yīng)性，共同促進(jìn)腸道的免疫穩(wěn)定。除此之外，腸道宿主菌可以選擇性上調(diào)腸道消化酶，增加宿主對單糖和短鏈脂肪酸的吸收，從而促進(jìn)宿主對能量的攝取與貯存。因此，本文綜述了腸道微生物的定植及影響因素、腸道微生物與腸屏障功能的互作影響、外源益生菌對腸道宿主菌與腸上皮細(xì)胞功能的調(diào)控作用等，以期為益生菌調(diào)控動物腸道健康提供理論依據(jù)。

1 腸道微生物早期定植及影響因素

動物消化道微生物由大量的革蘭氏陽性菌組成，以擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群。生態(tài)學(xué)家馬克·維倫德將微生物的早期定植分為分散、選擇、漂移和多樣化4 種[2]。

1.1 分散 哺乳動物剛出生時(shí)處于無菌狀態(tài)，暴露于宮外環(huán)境是其接觸高水平外源微生物的第一步。出生8 d 后嬰兒的糞便中微生物的分析結(jié)果表明，最初的微生物定植主要來源于母體微生物區(qū)系[3]，陰道正常分娩嬰兒的微生物區(qū)系以在母體陰道中發(fā)現(xiàn)的類群為主（乳桿菌、普雷沃氏菌、纖毛菌），而剖腹產(chǎn)分娩嬰兒的腸道菌群則富集于母體皮膚菌群（葡萄球菌、棒狀桿菌和丙酸桿菌）[4]。進(jìn)一步研究表明，母體與子代之間會存在菌株共享，母體腸道是子代最初微生物的重要來源[5]。母體幽門螺桿菌、大腸桿菌、類桿菌、擬桿菌和雙歧桿菌可在嬰兒的胃腸道中定植[6]。母體腸道微生物在早期通常被傳遞到嬰兒的腸道，因此，母體微生物的部分共生菌變化會影響嬰兒腸道菌群定植過程。研究發(fā)現(xiàn)，受不同生理階段代謝特點(diǎn)的影響，母豬在妊娠、泌乳和空懷等不同生理階段具有不同的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，與妊娠期微生物菌群結(jié)構(gòu)相比，泌乳期腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，而空懷期微生物菌群結(jié)構(gòu)組成則與妊娠期相接近。[7]。

1.2 選擇 兼性厭氧菌是最初定植于仔豬胃腸道的微生物，通常在出生后24～48 h 達(dá)到108～1010CFU/g[8]。此后，由葡萄球菌屬、腸球菌屬和乳桿菌屬占據(jù)主導(dǎo)地位。這些細(xì)菌通過消耗氧氣產(chǎn)生厭氧環(huán)境，從而為厭氧細(xì)菌提供有利條件[9]。早期研究表明，不同微生物類群在小鼠腸道環(huán)境的定植能力有所差異，從而使其占據(jù)不同的腸道生態(tài)位[10]。免疫系統(tǒng)和飲食是影響微生物選擇的2個(gè)主要因素。有研究表明，共生大腸桿菌菌株定植在缺乏B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的Rag2-/-小鼠胃腸道中的適應(yīng)速度比定植在具有完整的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的小鼠上更慢[11]。此外，在2 種基因型小鼠（NSG 和C57BL/6J）的腸道條件下，纖維素芽孢桿菌和糞樣芽孢桿菌有較高適應(yīng)度的富集，而由于硝酸鹽還原或固氮基因的富集導(dǎo)致木糖擬桿菌的豐度降低[12]。由此可見，免疫系統(tǒng)的成熟伴隨著對微生物區(qū)系的更多選擇。

1.3 漂移 微生物在腸道的定植是一個(gè)涉及大量細(xì)菌種類的動態(tài)過程。當(dāng)微生物在動物腸道中定植后，其生長速度和豐度不僅可以通過選擇來決定，還可以通過生態(tài)漂移來決定[13]。抗生素治療或者腹瀉等擾動因素會導(dǎo)致其腸道內(nèi)低豐度微生物群數(shù)量大量減少[14]。例如艾克曼菌屬、瘤胃球菌屬在腸道中的豐度很低。這些低豐度腸道微生物群落受到漂移的影響比選擇的影響更大。然而，由于漂移對腸道微生物群組裝的影響不明確，因此漂移和選擇這2 個(gè)過程難以區(qū)分[15]。

1.4 多樣化 微生物具有種群規(guī)模大、生長速度快、突變和重組率高等特點(diǎn)，在面臨強(qiáng)烈選擇時(shí)能夠迅速多樣化和適應(yīng)。研究表明，外源微生物與宿主本身體內(nèi)微生物群之間會存在生態(tài)競爭，宿主的共生微生物群落會影響外源微生物定植，高豐度的微生物群落（如空腸彎曲桿菌和艱難梭菌等）更易在腸道中定植[16]。

腸道微生物群的發(fā)育受飲食、藥物、分娩方式以及地理環(huán)境等因素影響[17]。嬰兒腸道微生物群的建立受飲食的顯著影響[18]。母乳中的乳糖、脂類和蛋白質(zhì)等成分是嬰兒的營養(yǎng)來源。此外，母乳中還含有豐富的免疫球蛋白，母乳來源的IgA 通過與微生物抗原結(jié)合選擇性地限制腸道免疫系統(tǒng)的激活和微生物的附著[19]，保證黏膜細(xì)菌的順利定植?？梢姡溉榧仁俏⑸飻U(kuò)散到腸道的來源，也是子代及其腸道微生物群的營養(yǎng)來源，其主導(dǎo)微生物受擴(kuò)散和選擇的影響。研究表明，乳汁中的微生物含量最高可達(dá)104～105CFU/g[20]。嬰兒出生后獲得乳汁中的微生物，使其從出生前在子宮內(nèi)Th2 型為主的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)槌錾骉h1/Th2 平衡的免疫應(yīng)答，從而激活腸道抗炎應(yīng)答，防止呼吸道疾病和腹瀉的發(fā)生[21]。

2 腸上皮屏障對腸道微生物群的調(diào)節(jié)

宿主-微生物的相互作用是免疫系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)。在免疫穩(wěn)態(tài)下，免疫系統(tǒng)耐受有益的共生細(xì)菌，但在組織破壞或其他穩(wěn)態(tài)擾動過程中，耐受性機(jī)制被打破，會對這些相同的微生物群作出反應(yīng)，引發(fā)組織損傷[22]。腸上皮細(xì)胞作為一個(gè)綜合的黏膜上皮屏障系統(tǒng)，可通過調(diào)控腸道內(nèi)微生物與與宿主免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而維持腸道健康。由腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的黏膜表面屏障分為物理屏障和化學(xué)屏障。

2.1 物理屏障 在小腸和大腸中，宿主防御的第1 道防線由黏液層提供。第1 類特殊上皮細(xì)胞稱為杯狀細(xì)胞，分泌黏蛋白2（MUC2）顆粒進(jìn)入腸尖腔[23]。MUC2 是一種糖蛋白，它形成由糖類修飾的基質(zhì)，包括唾液酸和巖藻糖[24]。在大腸中形成一個(gè)雙層屏障，外層被微生物定植，內(nèi)層大多沒有微生物，這不僅為微生物創(chuàng)造了物理屏障，同時(shí)為微生物定植提供了碳和其他營養(yǎng)來源[25]。聚合MUC2 的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不允許微生物輕易侵入結(jié)腸上皮。因此，在缺乏MUC2 的小鼠中，由于缺乏堅(jiān)固的內(nèi)黏液層，細(xì)菌能夠侵入大腸上皮，導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎[26]。黏液層成分的改變也會影響腸道微生物群，微生物信號的先天感知是黏液分泌所必需的[27]。小腸中的黏液層是不連續(xù)的，由第2 類特殊上皮細(xì)胞-潘氏細(xì)胞分泌的抗菌肽在分離宿主和微生物中起著更大的作用[28]。α-防御素、β-防御素、Reg3-γ和HNP-1 等抗菌肽與某些細(xì)菌的膜結(jié)合時(shí)具有殺菌作用[29]。與MUC2 分泌相似，抗菌肽分泌需要轉(zhuǎn)錄微生物信號，并且作為一種選擇性屏障，保護(hù)腸上皮細(xì)胞[30]。

腸道內(nèi)部黏膜層保持幾乎無菌的狀態(tài)。IgA 和由腸上皮細(xì)胞運(yùn)輸或產(chǎn)生的防御素家族等各種抗菌分子參與調(diào)節(jié)大腸和小腸中的腸道細(xì)菌[31]。B 細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA（sIgA），具有微生物抗原特異性，進(jìn)入腸腔后能中和并排斥上皮細(xì)胞中的病原微生物[32]。在結(jié)腸炎等炎癥過程中，IgA 涂層增加，如果特定的類群（如分段絲狀細(xì)菌）定植于更接近上皮細(xì)胞的位點(diǎn)，會增強(qiáng)其靶向性[33]。在腸道中，sIgA 涂層可以靶向細(xì)菌，但不激活補(bǔ)體，腸道微生物與sIgA 結(jié)合后具有定植優(yōu)勢[34]。

第2 道抵御入侵細(xì)菌的屏障是腸上皮細(xì)胞上的糖萼。糖萼是糖脂或糖蛋白的碳水化合物部分的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括跨膜黏蛋白，如MUC1、MUC13 和MUC17[35]。這些跨膜黏蛋白保護(hù)腸道組織免受腸道細(xì)菌病原體的侵害。微生物（如幽門螺桿菌）可以通過巖藻糖基化和唾液酸化聚糖與MUC1 結(jié)合。此外，MUC1 可限制小鼠幽門螺桿菌的密度和細(xì)胞的黏附作用，保護(hù)宿主免受細(xì)菌侵害[36]。MUC13 和MUC1 也可參與細(xì)胞對炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。MUC13 和MUC1 敲除會破壞屏障的完整性，顯著增強(qiáng)炎癥、細(xì)胞侵襲性和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用[44]。此外，MUC17 水平降低與腸侵襲性大腸桿菌的通透性增加及細(xì)菌侵襲增強(qiáng)有關(guān)[37]。

第3 道對抗微生物入侵的腸道物理屏障是細(xì)胞連接，包括緊密連接、黏附連接和黏附分子之間的相互連接。緊密連接由50 多種蛋白組成，分為結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白主要有claudins、occludins 和連接黏附分子（JAMs）等，它們構(gòu)成緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架；功能蛋白主要有ZO-1、ZO-2、ZO-3 等，連接細(xì)胞骨架及膜蛋白，傳遞信號[38]。研究表明，ZO-1 缺失會使得小鼠腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生，表明緊密連接的改變可能是腸道炎癥反應(yīng)的原因[39]。

2.2 化學(xué)屏障 腸上皮細(xì)胞至少包括分泌型和吸收型腸細(xì)胞兩類。分泌型腸細(xì)胞進(jìn)一步分為3 個(gè)細(xì)胞亞群，即產(chǎn)生黏液的杯狀細(xì)胞、產(chǎn)生抗菌肽的潘氏細(xì)胞和分泌激素的腸內(nèi)分泌細(xì)胞[40]。

潘氏細(xì)胞含有高濃度的抗菌蛋白，包括α-防御素、溶菌酶、C 型凝集素和磷脂酶A2。潘氏細(xì)胞有助于控制小腸腔的微生物密度。潘氏細(xì)胞可分泌抗菌肽α-防御素5 和6[41]。在腸隱窩中，防御素濃度為15～100 mg/mL，當(dāng)細(xì)菌抗原（如脂多糖）刺激Toll 樣受體和細(xì)胞內(nèi)傳感器（如NOD2 和NLRs）時(shí)，可誘導(dǎo)防御素的產(chǎn)生[42]。潘氏細(xì)胞可通過髓樣分化因子（MyD88）調(diào)節(jié)抗菌凝集素Reg3γ的產(chǎn)生。腸上皮細(xì)胞MyD88 缺失的老鼠，其抗菌肽分泌減少，易受細(xì)菌感染，從而導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)生。Reg3γ通過與細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)合，對革蘭氏陽性菌具有殺菌作用，小鼠抗菌凝集素Reg3γ喪失使得與小腸上皮的共生空間分離減少，導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎[43]。

Reg3 家族蛋白主要是由潘氏細(xì)胞產(chǎn)生的C 型凝集素。通過與肽聚糖結(jié)合，形成膜穿透孔，對革蘭氏陽性細(xì)菌表現(xiàn)出殺菌活性[44]。Reg3γ通過抑制革蘭氏陽性細(xì)菌，在小腸腸道細(xì)菌和腸上皮細(xì)胞的空間分離中起著至關(guān)重要的作用。此外，腸道微生物可通過TLR/MyD88途徑和ILC3 細(xì)胞釋放的IL22 促進(jìn)Reg3gγ的表達(dá)[45]。

3 腸道微生物對腸上皮細(xì)胞功能的影響

3.1 消化功能 腸道微生物中的益生菌可刺激宿主消化道內(nèi)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種消化酶的產(chǎn)生并提高其活性，有利于植物性碳水化合物和飼料中復(fù)雜物質(zhì)的降解，進(jìn)而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。有研究表明，飼喂含12%復(fù)合益生菌的發(fā)酵飼糧可提高斷奶仔豬胰臟和十二指腸內(nèi)容物脂肪酶、胰蛋白酶和淀粉酶的活性及空腸和回腸黏膜乳糖酶和麥芽糖酶的活性[46]。德氏乳桿菌可提高仔豬胰蛋白酶和胰脂肪酶活性，并能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)胰腺消化酶基因的表達(dá)[47]。研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵豆粕提高了斷奶仔豬空腸和回腸內(nèi)的淀粉酶活性及空腸內(nèi)麥芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶的活性[48]。腸道消化酶活性提高可促進(jìn)腸上皮對單糖和小肽的吸收，并可通過提高轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而提升營養(yǎng)物質(zhì)的吸收水平[49]。

3.2 吸收功能 單糖是所有動物必需的養(yǎng)分和關(guān)鍵的供能物質(zhì)，由食物經(jīng)消化酶作用產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化而成。鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SGLT-1）是胃腸道重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子[50]，主要表達(dá)于小腸黏膜上皮的刷狀緣，在腸道吸收葡萄糖和半乳糖的過程中發(fā)揮重要作用[51]。SGLT-1 的主要功能是以2:1 的比率協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子和葡萄糖，主要負(fù)責(zé)調(diào)控介導(dǎo)腸腔內(nèi)葡萄糖在消化道的吸收[52]。單糖由特定轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，如溶質(zhì)載體家族中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT-2）可將單糖轉(zhuǎn)運(yùn)到腸基膜，供腸細(xì)胞吸收[53]。研究表明，益生菌通過調(diào)控小腸SGLT-1 和GLUT-2 的表達(dá)調(diào)控小鼠體內(nèi)葡萄糖的攝取[54]。此外，復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵豆粕可顯著提高空腸絨毛高度和十二指腸的絨隱窩比，十二指腸和空腸SGLT1 mRNA 相對表達(dá)量升高，上調(diào)回腸中小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（PepT1）、水通道蛋白1（AQP1）mRNA 相對表達(dá)量[55]。

3.3 免疫功能 腸道微生物主要是通過Toll 樣受體介導(dǎo)的抗感染反應(yīng)、黏附定植、影響免疫球蛋白和免疫細(xì)胞等對免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用[56]。母乳喂養(yǎng)的新生兒腸道優(yōu)勢菌群為雙歧桿菌和乳酸桿菌。研究表明，嗜酸乳桿菌通過黏附在腸上皮細(xì)胞上，在腸細(xì)胞表面形成一層生物屏障，可以減少大腸桿菌對腸上皮細(xì)胞的黏附作用，調(diào)節(jié)腸道緊密連接，增強(qiáng)屏障功能[57]。此外，給小白鼠灌喂瑞士乳酸桿菌后發(fā)現(xiàn)，小腸中sIg A 漿細(xì)胞的量有所增加，說明乳酸桿菌可增強(qiáng)腸道淋巴細(xì)胞活性，使Ig A 分泌量逐漸增加，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[58]。細(xì)胞因子產(chǎn)生于天然免疫和特異性免疫的效應(yīng)階段，介導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)并實(shí)施有效的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，活的羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌能抑制促炎因子（TNF-α和LPS）誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞表達(dá)或分泌促炎細(xì)胞因子IL-8 或者IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-23，并阻止大腸桿菌誘導(dǎo)的IL-10 下調(diào)，從而限制上皮細(xì)胞的促炎應(yīng)答，促進(jìn)免疫平衡的恢復(fù)[59]。

4 結(jié) 語

腸道內(nèi)棲息著超過40 萬億個(gè)微生物，它們與其生存環(huán)境共同組成腸道微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生物群是影響宿主免疫系統(tǒng)的重要因素，細(xì)菌通過進(jìn)化以適應(yīng)在腸道極端條件下生存，絕大多數(shù)腸道細(xì)菌對宿主是有益的。腸道微生物群的紊亂與炎癥性腸病（IBD）等免疫學(xué)疾病有關(guān)。因此，腸道免疫與微生物之間的相互作用既有利于健康的微生物群落，又有利于宿主的個(gè)體健康。從微生物早期定植過程來看，腸道微生物群落不斷變化并逐漸趨于成熟，適應(yīng)良好的微生物能影響適應(yīng)較差的微生物在腸道的定植順序。盡管不適應(yīng)的菌株能夠迅速多樣化并發(fā)揮優(yōu)先效應(yīng)，但只有當(dāng)它們較早到達(dá)并利用該生態(tài)位中的資源時(shí)，才會發(fā)生這種情況。早期腸道免疫發(fā)育高度依賴于腸道微生物菌群，腸道微生物能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液，以加強(qiáng)黏膜屏障。同時(shí)，腸道微生物能通過黏附作用在腸上皮細(xì)胞上形成生物屏障，增強(qiáng)腸上皮的緊密連接。