單純皰疹病毒2型結構的生物學功能分析

段素琴 李琦涵

HSV-2病毒屬于人類皰疹病毒家族中α-亞族的成員，有資料顯示，該病毒已造成超過10億的15～49歲人群感染，每年新發(fā)病例估計為2300萬[1]。生殖器HSV-2感染一般通過性傳播，感染后終生潛伏于骶背根神經(jīng)節(jié)中，在特定的情況下通過再激活導致臨床癥狀復發(fā)或低效價排毒[2]。生殖器皰疹引起的重要臨床表現(xiàn)還包括復發(fā)性腦膜炎、新生兒皰疹病毒感染以及自閉癥等。雖然目前抗病毒療法可減短HSV-2臨床癥狀的持續(xù)時間，但不能完全防止病毒感染或消除潛伏期，顯然其保護作用是不完全的，因此預防HSV-2的感染和傳播仍然是疫苗開發(fā)的重要目標[3～5]。

HSV-2完整病毒顆粒為直徑125nm的球形，其基本結構由內(nèi)向外由核心部分、核衣殼、皮層和包膜組成。HSV-2病毒顆粒感染細胞的過程中編碼大約80多種蛋白質分子和一些RNA分子，主要包括由病毒包膜糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM等)、病毒核衣殼結構蛋白(VP4、VP19c、VP21、VP22、VP23、VP24、VP26等)以及約20%病毒蛋白為其復制增殖相關的功能蛋白。另外>50%具有編碼功能的蛋白參與了與宿主的相互作用，促使病毒在體內(nèi)得以存活，這也從側面說明了HSV-2病毒結構以及其與宿主細胞的相互作用具有復雜性。針對HSV-2感染后與宿主細胞的相互作用以及HSV-2編碼蛋白與機體免疫系統(tǒng)相互作用的研究，將有助于HSV-2疫苗的研發(fā)以及機體抗HSV-2病毒免疫應答機制的研究。

一、基因組的基本結構與生物學意義

HSV-2病毒核心部分約75nm左右，由雙鏈DNA基因組和病毒DNA結合蛋白構成。HSV-2基因組長約154.7kb，分為獨特的長片段(UL)和獨特的短片段(US)，兩側是反向重復序列，如此大的基因組遺傳信息從側面反映了該病毒的物種進化程度及其與宿主細胞相互作用的復雜程度[6]。研究表明，HSV-2病毒基因編碼80多種蛋白質的基因結構，具有一套相互配合但較為復雜的激活與抑制、增強與減弱調控機制。在HSV-2裂解性增殖的過程中，編碼80余種的蛋白質分子的編碼基因并不是同時開始工作的，在基因的嚴謹調控機制下，病毒基因組的立即早期(IE)、早期(E)和晚期(L)基因的有序激活，依次表達為α、β、γ基因產(chǎn)物，并且這些基因受到轉錄水平的調控。

HSV-2病毒基因組DNA的合成是在細胞核中以滾環(huán)機制進行復制的，在病毒感染后4h即開始復制，14h后達到高峰，中間過程需要多種酶的參與。參與DNA裝配的主要編碼蛋白有UL6、UL12、UL17、UL15、UL25、UL28、UL32、UL33等。UL6基因編碼的12個蛋白為核衣殼上的DNA入口，存在于核衣殼前體的結構中。UL12間接參與了病毒DNA的包裝過程。UL25主要將病毒DNA固定于核衣殼內(nèi)，與核衣殼結構蛋白一起參與DNA的包裝過程[7]。因此可見HSV-2病毒基因組的增殖性復制，實際上是病毒自身調控蛋白與細胞內(nèi)特定分子之間相互作用的結果。

二、HSV-2病毒顆粒三維結構分析

核衣殼包裹在核心部分外面，表現(xiàn)為直徑約為100nm的二十面體的立體對稱性結構。核衣殼不僅為病毒基因組提供了容納空間及保護性外殼，保護病毒基因組免受機械損傷等，并在感染的初期將病毒基因組釋放到宿主細胞核中，繼而包裝病毒及介導病毒感染宿主細胞的生物學效應。

基于物理電子技術學的發(fā)展，人們對皰疹病毒核衣殼內(nèi)部結構及某些結構蛋白的空間構象分析產(chǎn)生了相對清晰的認識[8,9]。早期通過密度梯度離心法發(fā)現(xiàn)，在HSV-2感染宿主細胞的過程中，?？梢姷接?種形式的HSV-2核衣殼出現(xiàn)，亦稱A、B、C 型[10]。其中A型核衣殼是空衣殼，是DNA包裝過程中的流產(chǎn)形式，其中無DNA和DNA結合蛋白，始終以空衣殼的形式存在，多見于空衣殼形成的起始階段。B型核衣殼含有DNA結合蛋白，很少或者不含DNA，為發(fā)育成熟中的衣殼，對病毒DNA具有親和性，可以引起DNA的進入而轉化成為C型核衣殼成為有傳染性的病毒顆粒。C型核衣殼位于核周間，由于含有完整的病毒DNA，可以發(fā)展成熟為具有感染力的病毒顆粒。

這3種核衣殼均為二十面體對稱結構，主要由955個150kDa的主要衣殼蛋白VP5排列為150個六邊形和11個五邊形，其他關鍵組件包括：12個頂點的十二聚體pUL6復合物；320份“三聯(lián)體”，由VP232和VP19c組成，主要連接相鄰的衣殼；900個VP26是六邊形外表面的組成部分之一。基于這樣復雜的結構背景，HSV-2殼體組裝是一個復雜的、嚴格遵循蛋白質結構熱力學原理的過程。其中B型核衣殼中特有支架蛋白VP22a，該特有的結構可能在病毒包裝過程中具有重要的意義，也可能是折疊蛋白VP22a的蛋白水解消化不成功或包裝病毒DNA失敗而產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，但是目前A型和B型核衣殼是流產(chǎn)形式還是裝配中間體仍有爭議[11,12]。

那么這些核衣殼形式在病毒生命周期以及與宿主免疫中是如何發(fā)揮作用的？3種核衣殼結構是否存在來不及組裝或在包裝的過程中導致細胞的裂解后作為病毒抗原與宿主發(fā)生先天性和適應性免疫應答相關？由于當前技術無法評估病毒結構變化的動力學，這些重要問題至今仍未得到解答。

三、HSV-2的皮質及生物學意義

在HSV-2的結構成分中，間層蛋白是位于核衣殼與外膜之間的約占30～35nm的蛋白分子，是皰疹病毒所特有的一類蛋白，主要參與病毒基因的復制轉錄、蛋白質合成及阻斷宿主細胞大分子的合成等作用[13,14]。目前在皰疹病毒成熟顆粒的結構中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多種間層蛋白，主要包括VP16(UL36)、VP11/12(UL46)、VP13/14(UL47)、VP16(UL48)、VP22(UL49)、ICP0、ICP4、VHS(UL41)、US2、US3、US10、US11、UL11、UL13、UL14、UL16、UL17、UL21、UL37、UL51、UL56。大多數(shù)間層蛋白作為結構蛋白形式存在，主要通過之間的相互作用來錨定在核衣殼或膜上穩(wěn)定病毒結構[15]。又可以作為功能蛋白主要在病毒的復制過程中發(fā)揮特定的生物學作用(病毒基因轉錄調節(jié)功能)，例如UL36和UL37。此外也有部分間層蛋白作為特定組分與細胞因子組分。

一些間層蛋白也參與了病毒的結構網(wǎng)絡，其主要通過與細胞分子的相互作用而發(fā)揮重要作用。中間層蛋白VP16和VHS是研究相對較多的兩種間層蛋白，主要集中在調節(jié)病毒基因組轉錄和干擾宿主RNA合成中的生物學功能的研究。病毒感染細胞之后，VP16作為最接近包膜的間質蛋白，主要通過與細胞表面分子OCT-1、HCF1結合形成誘導復合物，識別α基因上具有調控功能的TA結構，進而發(fā)揮反式激活作用，誘導5個立即早期蛋白——感染細胞多肽ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47的表達。VP16還能夠與由UL36和UL37基因編碼的兩個外皮蛋白一起參與支持病毒結構，同時該蛋白對包裝后病毒釋放出細胞也起著重要的作用[16]。VHS作為一種mRNA特異性的RNA酶，能夠引起宿主細胞蛋白質合成的快速關閉，在病毒基因從頭合成前就能降解宿主細胞的mRNA，為病毒增殖期間的轉錄提供了空間[17～19]。

研究表明，間層蛋白在細胞感染的過程中具有病理學意義。有研究顯示，間層蛋白在病毒感染的過程中可以被免疫系統(tǒng)識別后下調病毒的病理學作用。此外，一些間層蛋白的缺失也會影響病毒的發(fā)病機制，例如在病毒感染的細胞中可見UL7、UL7-UL51復合體與gE在感染細胞的核區(qū)域共定位，但是UL7的缺失卻消除了這種共定位[20]。雖然此基因的部分缺失沒有影響病毒的結構，但是可能會限制病毒在細胞或動物中的增殖并導致病毒的生長動力學延遲，因為UL7調節(jié)病毒α基因的轉錄，可能會導致病毒的表型減弱[21,22]。由此可見，病毒感染宿主之后大多數(shù)病原性病毒分子都是在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮一定的作用，并且通過免疫逃逸的方式避免先天性和適應性的監(jiān)控。

基于以上的認識，可以認為在病毒復制的過程中，作為結構蛋白的間層蛋白與作為功能蛋白的α基因具有相似的的生物學功能。如上所述，HSV-2所具有的復雜的病毒基因結構和基因調控系統(tǒng)，均能與宿主細胞的基因轉錄調控系統(tǒng)相互作用，從而為病毒復制創(chuàng)造有利的分子生物學背景，可見病毒在增殖的過程中發(fā)生了與宿主細胞多方面、多層次的相互作用。如此結構與功能特性的間層蛋白形成了HSV-2感染細胞過程中的特殊背景，為HSV-2感染宿主細胞構建了有利于病毒復制增殖的微環(huán)境，而該微環(huán)境所表現(xiàn)的抗原特性是否能被感染細胞所釋放的天然免疫信號分子激活，以識別異物分子進而被優(yōu)勢中和抗體反應所拮抗或清除尚未有充分的依據(jù)。

四、HSV-2的外膜蛋白及生物學意義

HSV-2作為一種有包膜的DNA病毒，在最外側是有多層突起結構的囊膜。外膜蛋白作為結構蛋白可以介導病毒進入細胞，通過與宿主細胞膜上的非特異性的受體結構介導病毒囊膜與細胞膜的融合，使病毒進入細胞并完成生物學功能。此外，外膜蛋白攜帶的抗原表位能夠誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體及CTL應答，因此常作為研制HSV疫苗的主要免疫原，在HSV病毒疫苗的研究有重要的作用。

囊膜上有多種病毒編碼產(chǎn)生的糖蛋白(glycoprotein)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)有多達12種，主要與病毒的吸附、入侵和刺激機體發(fā)生免疫反應有關。已經(jīng)證明至少有5種糖蛋白gB、gC、gD、gH和gL能夠與細胞受體相互作用，從而促進病毒進入宿主細胞。HSV-2病毒通過gB或gC與細胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白HSPG非特異性的結合，并與成對的免疫球蛋白樣2a型受體(PILR)偶聯(lián)后使得病毒與細胞膜靠近。接著gD與細胞膜上的特異性的受體結合(皰疹病毒進入介導子HVEM、指蛋白1 nectin1 HveC、指蛋白2 nectin2 HveB、硫酸乙酰肝素黏蛋白 3-OST-3等)后進一步啟動gH、gL、gK的作用，從而形成包含兩種糖蛋白的復合物，發(fā)揮gB介導的病毒囊膜與細胞膜的融合作用[23～25]。也有數(shù)據(jù)證明gH和gL以細胞整合素為受體在細胞膜融合過程中發(fā)揮重要的作用，這些從側面說明了HSV-2進入細胞有相對系統(tǒng)的方式，即在整個組裝過程中表現(xiàn)出的特化的、以分子間相互作用方式的蛋白質動力學事件[26]。因此，病毒進入細胞的過程涉及到多種表面糖蛋白與不同的細胞受體之間的相互作用，這也從側面支持了完整的中和抗體可能是由多種抗體共同構成綜合抗體這一觀點。

近年來在疫苗研發(fā)方面，gB、gD常被認為優(yōu)勢抗原進行抗原肽疫苗的研發(fā)，這些候選疫苗經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)在有效性和安全性方面都有較好的結果[27]。但在臨床試驗中，人類受試者并未得到相應的臨床保護，導致這種現(xiàn)象的原因可能為糖蛋白是否是人們傳統(tǒng)認為的刺激機體發(fā)生免疫反應的優(yōu)勢抗原還沒有得到充分的證實，可能病毒糖蛋白作為候選疫苗所引起的免疫應答，不能刺激病毒感染不同階段瞬時表達各種抗原分子，并且病毒表面糖蛋白所產(chǎn)生的特異性抗體和CTL應答，無法真正控制病毒感染宿主細胞后出現(xiàn)的各種病理性損傷[28，29]。結合流行病的數(shù)據(jù)表明，人群中血清抗體的存在并不能阻止HSV感染的發(fā)生。

綜上所述，筆者推測HSV-2病毒感染具有一套完善的免疫逃逸機制，推測發(fā)生免疫逃逸的原因可能為病毒進化后可以建立潛伏感染功能以及能感染多種細胞類型[30]。主要表現(xiàn)為干擾宿主細胞PRR對其PAMP的識別，抑制干擾素的產(chǎn)生，阻礙補體級聯(lián)反應，導致多種固有免疫細胞和特異性免疫細胞的凋亡降解，從而抑制宿主的抗病毒免疫效應及發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象。此外，HSV編碼多種病毒蛋白也是免疫逃逸的原因之一。

五、展 望

目前針對HSV-2編碼的病毒蛋白分子的抗原特性研究尚未明確，但針對不同蛋白分子的研究表明，部分蛋白分子存在一定數(shù)量的T細胞和B細胞反應位點，這決定了機體針對這些病毒蛋白出現(xiàn)特異性CTL應答及中和抗體。因此，深入認識這些病毒編碼分子的生物學功能，對于理解這些蛋白在感染過程中發(fā)揮的免疫作用具有重要的意義，從而進一步認識HSV-2疫苗研究的可行性。