Meesmann角膜上皮營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病機(jī)制及治療的研究進(jìn)展

薛海娜，王麗媛，鄭濤，趙楚楚，張毅，劉含若，劉平

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，哈爾濱 150001； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京市眼科研究所，北京 100730)

Meesmann角膜上皮營(yíng)養(yǎng)不良(meesmann epithelial corneal dystrophy，MECD)是一種以上皮含有細(xì)小微囊為主要特征的罕見(jiàn)角膜遺傳性疾病，主要發(fā)生在歐洲地區(qū)。MECD發(fā)病的最小年齡為6個(gè)月，但由于疾病進(jìn)展緩慢且無(wú)顯著癥狀，大部分患者直至青春期才被診斷[1]，因此又稱為青少年遺傳性MECD。MECD患者主要表現(xiàn)為流淚、畏光、眩光、異物感以及輕度視力下降，嚴(yán)重者可出現(xiàn)反復(fù)上皮糜爛，導(dǎo)致角膜出現(xiàn)新生血管并累及角膜前彈力層。1997年，Irvine等[2]發(fā)現(xiàn)，角蛋白(keratin，KRT)3基因或KRT12基因錯(cuò)義突變可改變相應(yīng)KRT3蛋白和KRT12蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MECD患者角膜上皮結(jié)構(gòu)的穩(wěn)固被破壞。目前，MECD的發(fā)病機(jī)制主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、未折疊蛋白反應(yīng)和凋亡[3]。另外，自噬[4]、晶體蛋白[5]等也可能與MECD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前仍存在爭(zhēng)議。對(duì)于癥狀輕微的MECD患者，只需對(duì)癥治療，而對(duì)于癥狀較重或反復(fù)發(fā)作的MECD患者目前最有效的治療方式是角膜移植，但仍有一定的復(fù)發(fā)率。在體外和動(dòng)物疾病模型中，小干擾RNA、規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，cas9)系統(tǒng)均被證實(shí)可有效治療MECD[3,6]?，F(xiàn)就MECD發(fā)病機(jī)制及治療的研究進(jìn)展予以綜述。

1 MECD的發(fā)病機(jī)制

1.1個(gè)體表型的表現(xiàn)及影響因素 MECD患者在裂隙燈檢查下可見(jiàn)微囊性上皮混濁，在逆光照射下可觀察到大量透明、細(xì)小的微囊分散或局限于眼瞼間區(qū)并延伸至角膜緣，裂隙燈下也能觀察到灰色平行線樣改變和無(wú)病變區(qū)域[7]。透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，MECD患者上皮細(xì)胞胞質(zhì)中含有大小不等的空泡，在空泡中含有一些類(lèi)似于溶酶體的膜結(jié)合體[8]。利用光學(xué)相干斷層成像檢查眼前段發(fā)現(xiàn)，除小泡外，慢性炎癥患者的角膜上皮層較正常上皮層厚，且上皮細(xì)胞中存在高反射性物質(zhì)[7]。體內(nèi)激光共聚焦顯微鏡檢查也發(fā)現(xiàn)了與光學(xué)相干斷層成像相似的高反射物質(zhì)表現(xiàn)[9]。既往研究表明，微囊中角膜上皮的高反射性物質(zhì)為退行性細(xì)胞，而基底膜的高反射性物質(zhì)為增生的基底膜，類(lèi)似于上皮基底膜營(yíng)養(yǎng)不良的病理改變[10]。值得注意的是，雖然MECD主要累及角膜上皮，但其病理改變甚至可影響前彈力層。

MECD的表型可能與氨基酸突變類(lèi)型相關(guān)，如攜帶KRT12-L132P基因突變的MECD患者的臨床癥狀及病理?yè)p害較KRT12-L132H基因突變的MECD患者更嚴(yán)重[3]。KRT12-L132P基因突變的MECD患者角膜含有微囊且上皮纖維化的比例更高，但也并非絕對(duì)，相同基因突變的患者在不同地區(qū)會(huì)出現(xiàn)不同的癥狀。如1例美國(guó)KRT12-L132P基因突變的MECD患者無(wú)癥狀，而部分日本相同基因突變MECD患者則表現(xiàn)為干眼、異物等癥狀且病理?yè)p害更嚴(yán)重[7]。

1.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng) KRT12基因錯(cuò)義突變可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)。有研究在攜帶KRT12-L132P基因突變的人源化小鼠角膜上皮中觀察到KRT聚集，提示KRT12-L132P基因突變是MECD的重要致病因素[3]。未折疊蛋白反應(yīng)首先通過(guò)減少蛋白質(zhì)的生物合成緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超載，并上調(diào)細(xì)胞質(zhì)分子伴侶蛋白(如熱激蛋白)水平，糾正錯(cuò)誤折疊，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白可結(jié)合未折疊蛋白，使底物蛋白保持易折疊的狀態(tài)。適應(yīng)性反應(yīng)通過(guò)3個(gè)分支系統(tǒng)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，即蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、需肌醇酶1、活化轉(zhuǎn)錄因子6分別與免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白解離后活化[12]。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和需肌醇酶1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ型跨膜糖蛋白，活化轉(zhuǎn)錄因子6為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅱ型跨膜糖蛋白。蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通過(guò)磷酸化翻譯起始因子2α亞單位，使其不能形成翻譯起始復(fù)合物而抑制蛋白質(zhì)合成[12]。活化轉(zhuǎn)錄因子6可增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶編碼的轉(zhuǎn)錄活性，提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和降解能力；需肌醇酶1可幫助底物剪切、編碼轉(zhuǎn)錄因子并增強(qiáng)脂質(zhì)合成基因的活性[13]，而高脂肪酸和高膽固醇可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔擴(kuò)張，最終緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

由于錯(cuò)誤折疊蛋白的持續(xù)表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)在活化轉(zhuǎn)錄因子6和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶的誘導(dǎo)下被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。CHOP通過(guò)激活一系列凋亡反應(yīng)蛋白，使磷酸化的翻譯起始因子2α亞單位信使RNA去磷酸化，增加蛋白的翻譯和合成[12]。CHOP可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成過(guò)氧化環(huán)境或活化胱天蛋白酶(caspase)，caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)刺激caspase-9而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究顯示，與野生型小鼠相比，攜帶KRT12-L132P基因突變的人源化小鼠角膜上皮凋亡標(biāo)志物CHOP、caspase-12水平均升高；同時(shí)，在MECD患者角膜上皮中也發(fā)現(xiàn)了CHOP、caspase-12等促凋亡因子[15]。另有研究顯示，與野生型小鼠相比，KRT12-L132P基因突變小鼠模型角膜上皮凋亡水平增加了17倍[3]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可促進(jìn)鈣離子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致線粒體鈣超載、細(xì)胞色素釋放，促進(jìn)凋亡小體形成，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞凋亡[16]。

1.3KRT結(jié)構(gòu)的變化 KRT3(Ⅱ型、堿性KRT)和KRT12(Ⅰ型、酸性KRT)為角膜上皮細(xì)胞的骨架蛋白，可通過(guò)與核膜結(jié)合維持表皮的完整性。KRT由N端頭部、α-螺旋桿部和C端尾部組成，α-螺旋桿部由4個(gè)螺旋片段(即1A、1B、2A和2B)組成，通過(guò)非螺旋樣結(jié)構(gòu)的連接成分(L1、L12、L2)相互連接，而頭部和尾部的非螺旋區(qū)域含有大量磷酸化位點(diǎn)[17]。需要注意的是，螺旋起始基序(helix-initiation motif，HIM)和螺旋終止基序(helix-termination motif，HTM)結(jié)構(gòu)保守，HIM和HTM區(qū)域的基因突變可引起MECD。研究發(fā)現(xiàn)，最常見(jiàn)的KRT12基因突變是p.R135T，且僅在歐洲人中檢測(cè)到，推測(cè)可能與人種差異有關(guān)[18]。另有研究表明，p.L132P基因突變導(dǎo)致的臨床癥狀更嚴(yán)重[19]。除p.R84W在頭部發(fā)生突變外，KRT3中的所有突變均位于KRT3的HTM區(qū)域[3]，見(jiàn)表1。

KRT3和KRT12組裝成平行二聚體后，將兩個(gè)平行二聚體的桿部N端半部分重疊形成反向平行的四聚體，隨后組裝成“60 nm絲”，這些納米纖維在體外組裝形成厚度為10 nm的繩索狀納米絲[36]。

由于KRT3或KRT12基因突變，相應(yīng)的KRT3或KRT12蛋白結(jié)構(gòu)改變，形成不穩(wěn)定的平行二聚體，使細(xì)胞脆性增加。MECD患者角膜上皮中的KRT6和KRT6a表達(dá)上調(diào)可減少角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移，幫助上皮修復(fù)[3]。同時(shí)，KRT6還具有抗菌作用，而KRT16作為免疫調(diào)節(jié)的一員，一般在正常角膜上皮中無(wú)表達(dá)，但在MECD患者角膜上皮細(xì)胞中可觀察到KRT16的表達(dá)[37]。綜上，KRT6和KRT16在應(yīng)激反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)，包括紫外線應(yīng)激、切口愈合和氧化應(yīng)激。

在胚胎早期，KRT5和KRT14以異源二聚體的形式在基底層、角膜和角膜上皮中表達(dá)，隨著外周層中KRT12表達(dá)的增加，KRT14的表達(dá)逐漸減少[38]。相反，在無(wú)KRT12的情況下，其他KRT(如KRT14)可上調(diào)[5]。穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)聚不僅需要KRT中間絲的表達(dá)，還需要橋粒與中間絲的相互作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，KRT5/KRT14(主要是KRT5)支持穩(wěn)定且高度黏附的橋粒，而KRT6/KRT7則通過(guò)減少細(xì)胞間黏附增強(qiáng)橋粒的活性[39]。研究顯示，與正常角膜相比，MECD患者上皮細(xì)胞中的KRT5、KRT14、KRT6和KRT16蛋白豐度均顯著增加[3]。以上研究均提示，橋粒并不是MECD主要的致病機(jī)制。

1.4晶體蛋白在MECD中的作用 晶體蛋白是晶狀體的主要蛋白，可保持晶狀體的透明度。α晶體蛋白對(duì)晶狀體的細(xì)胞質(zhì)具有保護(hù)作用，包括抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)晶狀體細(xì)胞的抗應(yīng)激性、維持細(xì)胞骨架的完整性等；當(dāng)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β晶體蛋白、γ晶體蛋白也具有保護(hù)作用，其既可保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，又可抑制細(xì)胞凋亡[40]。因此，晶體蛋白在抑制角膜上皮細(xì)胞凋亡方面具有重要意義。同時(shí)，晶體蛋白與細(xì)胞骨架的相互作用可以防止中間絲的異常聚集。因此，與小熱激蛋白一樣，晶體蛋白在角膜上皮中作為分子伴侶識(shí)別變性蛋白，并主動(dòng)與變性蛋白結(jié)合形成小熱激蛋白底物復(fù)合物，阻止變性蛋白的積累[41]。在KRT12-L132P基因突變的純合子小鼠模型的角膜上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了晶體蛋白基因的上調(diào)[3]，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。綜上可知，晶體蛋白對(duì)MECD也有保護(hù)作用，不僅可防止異常的蛋白質(zhì)堆積，還可抑制MECD患者角膜上皮細(xì)胞凋亡。

1.5自噬 自噬是一種主要的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，可將非天然蛋白(如錯(cuò)誤折疊蛋白)放置在蛋白酶體和溶酶體的腔室中進(jìn)行降解[42]。自噬參與多種由KRT基因突變引起的疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性。KRT8可促進(jìn)年齡相關(guān)性黃斑變性模型視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激后自噬體和溶酶體的融合[4]。同樣，KRT5的自噬作用對(duì)于正常的包皮腺體分化也至關(guān)重要[43]。另外，KRT18的自噬作用也被證實(shí)[43]。共聚焦檢查發(fā)現(xiàn)，MECD患者角膜上皮可見(jiàn)溶酶體樣空泡，病理上可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)囊樣包涵體[44]。由于KRT的異常聚集，包裹體被蛋白酶體降解形成溶酶體樣空泡。自噬異常也是包涵體形成的原因之一。

2 治 療

目前MECD尚無(wú)有效的臨床藥物治療，若患者癥狀輕微(如畏光、流淚、眼干、異物感以及角膜上皮點(diǎn)狀缺損)只需對(duì)癥治療，如利用人工淚液、護(hù)目鏡、睫狀肌麻痹劑、角膜繃帶鏡等緩解癥狀。對(duì)于癥狀嚴(yán)重或反復(fù)發(fā)作的患者則需手術(shù)治療。目前的手術(shù)方式主要包括激光消融和角膜移植，但術(shù)后仍可能復(fù)發(fā)。

2.1激光消融治療 攜帶KRT12-L132P基因突變的MECD患者可出現(xiàn)復(fù)發(fā)性角膜上皮侵蝕和上皮下纖維化等嚴(yán)重癥狀，需要行上皮清創(chuàng)術(shù)、準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)[3]等，其中準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)是首選的治療方式。準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)可有效去除角膜上皮或前彈力層的病變區(qū)域，局部絲裂霉素C與準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)聯(lián)合治療可降低MECD患者的復(fù)發(fā)率[45-46]，但聯(lián)合治療后仍可能復(fù)發(fā)。如1例34歲女性MECD患者接受激光治療性角膜切削術(shù)后3個(gè)月角膜上皮微囊再次出現(xiàn)，且1年后出現(xiàn)視力下降[47]。另外，1例 33歲的白人男性MECD患者在接受激光治療性角膜切削術(shù)聯(lián)合絲裂霉素C治療后也出現(xiàn)了復(fù)發(fā)且視力下降[1]。

2.2角膜移植手術(shù)治療 隨著科技的進(jìn)步和手術(shù)方式的改進(jìn)，角膜移植已不再是首選治療方式。但對(duì)于癥狀嚴(yán)重且反復(fù)發(fā)作的MECD患者，板層角膜移植或穿透性角膜移植仍是最有效的治療方式[3]。穿透性角膜移植雖然是MECD最有效的治療方式，但角膜排異導(dǎo)致其風(fēng)險(xiǎn)增大，無(wú)法達(dá)到良好的預(yù)后效果。板層角膜移植術(shù)是近年的主流術(shù)式，主要優(yōu)點(diǎn)為創(chuàng)傷小，可以替換病變角膜上皮及前彈力層，且對(duì)角膜內(nèi)皮的影響較小，因此并發(fā)癥及術(shù)后的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，術(shù)后恢復(fù)快。但也有研究報(bào)道了MECD患者出現(xiàn)板層角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)或穿透性角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)的案例[2,47]。

2.3基因治療 目前關(guān)于MECD的治療研究主要集中于穩(wěn)定角膜上皮的小分子療法方面。一項(xiàng)應(yīng)用小干擾RNA治療KRT12基因突變小鼠模型的研究顯示，小干擾RNA治療的一個(gè)嚴(yán)重不良反應(yīng)為脫靶效應(yīng)，雖然可最小化MECD小鼠模型不必要的脫靶效應(yīng)，但未來(lái)還需在臨床試驗(yàn)中對(duì)患者是否存在脫靶效應(yīng)進(jìn)行全面評(píng)估[19]。CRISPR是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可有效防止病毒或質(zhì)粒DNA的入侵，CRISPR/cas9技術(shù)是目前醫(yī)療領(lǐng)域中最先進(jìn)的基因編輯方式，可通過(guò)靶向基因修飾矯正疾病基因的突變[6]。Courtney等[48]發(fā)現(xiàn)，在MECD患者的角膜中，KRT12-L132P基因突變可產(chǎn)生一個(gè)新的原間隔序列鄰近基序，為研究者提供了可設(shè)計(jì)的向?qū)NA與原間隔序列鄰近基序的相鄰序列互補(bǔ)，最終使致病基因不再表達(dá)；另外，CRISPR/cas9技術(shù)不僅在體外細(xì)胞中可顯著降低致病基因相關(guān)蛋白的表達(dá)，在攜帶KRT12-L132P基因的小鼠模型中也可觀察到KRT12-L132P基因內(nèi)的移碼缺失，為顯性錯(cuò)義突變的治療提供了新方向。

3 小 結(jié)

由于KRT12基因中的雜合突變導(dǎo)致KRT蛋白不能折疊成正確的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)沉積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而引起未折疊蛋白反應(yīng)緩解應(yīng)激狀態(tài)。此外，自噬和一些KRT上調(diào)也可幫助蛋白質(zhì)正確折疊來(lái)緩解應(yīng)激狀態(tài)。然而,未折疊蛋白反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)進(jìn)一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，形成微囊。當(dāng)細(xì)胞微囊向上移動(dòng)、破裂并形成上皮點(diǎn)狀缺損時(shí)，常被誤診為干眼的癥狀。此外,微囊的形成可能是由異常的平行二聚體增加了細(xì)胞脆性，使上皮細(xì)胞無(wú)法抵抗機(jī)械應(yīng)力所致。未折疊蛋白反應(yīng)和細(xì)胞凋亡機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，包括晶體蛋白和自噬的作用以及KRT的改變等。未來(lái)基因治療前景廣闊，但仍需大量研究驗(yàn)證。