柯薩奇病毒B3產(chǎn)生的2B蛋白影響鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

楊陽，劉文秀，王丹，鄭詩悅，趙德超

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，哈爾濱 150001)

心肌炎是一種由多種原因引起的心臟炎癥，與病毒感染密切相關(guān)，即病毒性心肌炎[1]。病毒性心肌炎患者的臨床表現(xiàn)輕重不一，輕者導(dǎo)致呼吸困難，重者可出現(xiàn)急性心力衰竭，患者的臨床結(jié)果由病毒毒力、免疫反應(yīng)以及治療干預(yù)間相互作用共同決定，而細(xì)胞凋亡在其中發(fā)揮重要作用[2-3]。細(xì)胞凋亡包括內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡，內(nèi)源性凋亡又分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡和線粒體途徑凋亡，因此在病毒性心肌炎的研究中心肌細(xì)胞凋亡的機制至關(guān)重要。與人類心肌炎相關(guān)的病毒包括腸道病毒、腺病毒、皰疹病毒以及人類免疫缺陷病毒等，而腸道病毒中的柯薩奇病毒(coxsackievirus，CV)B3是患者心肌活檢中最常見的病原體之一[4-5]。2B蛋白是CVB3產(chǎn)生的一種關(guān)鍵非結(jié)構(gòu)蛋白，具有Viroporin樣活性，可插入細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜中，影響宿主細(xì)胞膜的生物學(xué)功能、破壞宿主細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[6]。作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體共同維持細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)，同時也參與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的過程[7]?，F(xiàn)就CVB3產(chǎn)生的2B蛋白影響鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展予以綜述。

1 小RNA病毒CVB3

1.1CVB3的結(jié)構(gòu)特點 小RNA病毒科包括腸道病毒(如CV和脊髓灰質(zhì)炎病毒)、鼻病毒(如人鼻病毒)等[5]。小RNA病毒均具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，其RNA基因組為6.7～10.1 kb，通常由7 500～8 000個核苷酸正鏈RNA分子組成，包含1個長的開放閱讀框、1個5′非翻譯區(qū)、1個3′非翻譯區(qū)和1個多聚腺苷酸尾[8]。開放閱讀框翻譯的RNA基因組會產(chǎn)生1個約2 200個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白分為P1、P2和P3區(qū)域，P1區(qū)域是包裹病毒RNA的結(jié)構(gòu)性蛋白，P2和 P3區(qū)域是參與病毒RNA復(fù)制的非結(jié)構(gòu)性蛋白[8-10]。

CVB3的遺傳信息存儲在1個長7.4 kb的小型單鏈RNA中，CVB3進(jìn)入細(xì)胞后，首先將小型單鏈RNA翻譯成1個單一的多聚蛋白，然后多聚蛋白被蛋白酶切割成單一的病毒蛋白[9]。CVB3可編碼產(chǎn)生4個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白以正確的方式聚集在一起，形成病毒衣殼，而非結(jié)構(gòu)蛋白具有協(xié)同作用，可使病毒接管宿主細(xì)胞，確保宿主細(xì)胞產(chǎn)生病毒RNA，同時使細(xì)胞膜裂解，將組裝好的CVB3顆粒釋放到細(xì)胞外液中，因此非結(jié)構(gòu)蛋白及其前體在宿主細(xì)胞內(nèi)具有多樣而各異的功能[9-10]。

1.2CVB3感染及損傷途徑 CV通過糞口途徑傳播導(dǎo)致人類或小鼠的心肌炎癥，特別是CVB3。首先CVB3通過宿主腸黏膜感染并在派爾集合淋巴結(jié)、脾臟的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中復(fù)制，然后CVB3被釋放到血液中并傳播至各器官(如心臟和胰腺)[4]。目標(biāo)細(xì)胞對病毒的內(nèi)化是通過其與2個表面因子的相互作用完成，首先衰變加速因子將病毒顆粒錨定到細(xì)胞表面，然后人類和小鼠共有的CV-腺病毒受體介導(dǎo)CVB3進(jìn)入細(xì)胞，而心肌細(xì)胞將病毒內(nèi)化是CVB3誘導(dǎo)心肌炎發(fā)生的前提條件[11]。在感染的宿主細(xì)胞中可以看到細(xì)胞質(zhì)中膜囊泡的大量增殖和積累，這些囊泡即是病毒RNA復(fù)制的部位[12]。

病毒感染可誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑以及先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)。大多數(shù)病毒在長期共同進(jìn)化的宿主關(guān)系中獲得了調(diào)節(jié)感染、限制宿主免疫反應(yīng)的能力。CVB3通過編碼多功能蛋白調(diào)控病毒繁殖以及逃避宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，這些非結(jié)構(gòu)蛋白不僅可影響宿主細(xì)胞膜運輸系統(tǒng)和蛋白運輸過程，還參與破壞宿主細(xì)胞的形狀并干擾其正常生理功能，以確保整個病毒生命周期的順利完成[9-10,13]。

2 2B蛋白

2.12B蛋白的結(jié)構(gòu) 2B蛋白是CVB3產(chǎn)生的關(guān)鍵非結(jié)構(gòu)蛋白，也是具有99個氨基酸殘基的跨膜蛋白，由2個疏水區(qū)域(hydrophobic region，HR)組成，即HR1和HR2。HR1是兩親性的α-螺旋，HR2則形成完全疏水的螺旋；HR1和HR2與連接的莖環(huán)相互作用形成“螺旋-角-螺旋”結(jié)構(gòu)，而這樣的結(jié)構(gòu)可以在脂質(zhì)雙分子層中以四聚體的形式組裝成親水性孔[6,13]。研究表明，2B蛋白與細(xì)胞器膜或細(xì)胞膜的正確結(jié)合及改變膜通透活性均需要HR1和HR2的共同存在，2B蛋白在CVB3的生命周期中起關(guān)鍵作用，可通過誘導(dǎo)一系列宿主細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)CVB3的復(fù)制和釋放[14]。

2B蛋白是病毒孔蛋白Viroporins家族的一員，而Viroporins是低分子量跨膜蛋白家族，包含50～120個氨基酸，其作用方式是單體聚合形成親水孔后嵌入宿主細(xì)胞膜發(fā)揮功能[14]。Viroporins分為ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB 4種亞型，其中ⅡA型的C端和N端延伸至細(xì)胞器腔，而2B蛋白在結(jié)構(gòu)上即屬于ⅡA型，即C端和N端均位于細(xì)胞器的腔內(nèi)[14-15]。病毒編碼的Viroporins不僅與病毒致病性相關(guān)，還參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的電化學(xué)平衡，并影響病毒的復(fù)制，因此Viroporins家族有望成為抗病毒治療的潛在靶點[16-17]。

2.22B蛋白的膜定位和功能 2B蛋白的特定結(jié)構(gòu)決定了其膜定位，特別是在細(xì)胞膜、高爾基體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中。2B蛋白在細(xì)胞膜、高爾基體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中形成孔隙，破壞了膜的完整性，可誘導(dǎo)膜重塑并阻滯蛋白的運輸[6,9]。已有研究證明，2B蛋白單獨表達(dá)即可誘導(dǎo)Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變，免疫組織化學(xué)染色顯示，2B蛋白通過影響質(zhì)膜通透性使細(xì)胞外Ca2+流入，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高；同時還可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+外流，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+外流可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致線粒體Ca2+吸收減少[6,18]。以上研究均表明，CVB3產(chǎn)生的2B蛋白單獨表達(dá)即可導(dǎo)致質(zhì)膜通透性增強。

3 正常情況下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的Ca2+儲存庫和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要部位[19-20]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過特定的Ca2+通道保證攝取和釋放之間的平衡。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+攝取僅通過心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶以ATP依賴性方式將Ca2+主動泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放受蘭尼堿受體和肌醇1，4，5-三磷酸受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)控制，Ca2+本身對蘭尼堿受體和IP3Rs有雙相調(diào)節(jié)作用，低水平Ca2+可激活Ca2+攝取通道，而高水平Ca2+可抑制Ca2+攝取通道開放[7，10，19]。

正常情況下，線粒體通過調(diào)節(jié)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控ATP生成的關(guān)鍵酶，從而為細(xì)胞提供能量[20]。線粒體膜分為線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜，而線粒體外膜上具有電壓依賴性陰離子通道受體。研究表明，電壓依賴性陰離子通道與IP3Rs間存在物理連接，Ca2+通過電壓依賴性陰離子通道進(jìn)入線粒體外膜，在線粒體外膜與線粒體內(nèi)膜的接觸位點富集著線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白完整復(fù)合物，該復(fù)合物同樣參與Ca2+的攝取[7,20]。

線粒體基質(zhì)中的Ca2+積累主要通過線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白和線粒體內(nèi)膜上存在的膜電位完成。在靜息生理條件下，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運蛋白對于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的親和力較低，因此Ca2+的吸收速率非常慢，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接可以克服Ca2+攝取系統(tǒng)的低親和力，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+在局部即可達(dá)到較高水平[7]。因此，高水平的“Ca2+熱點”可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與線粒膜之間緊密靠近的區(qū)域內(nèi)短暫形成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體緊密結(jié)合位點間形成的這個具有高Ca2+水平的微域被稱為線粒體相關(guān)膜[7,21-22]。線粒體相關(guān)膜允許線粒體基質(zhì)內(nèi)大量Ca2+的快速吸收，導(dǎo)致線粒體代謝快速調(diào)節(jié)以滿足細(xì)胞的需求[23]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體可通過多種方式影響細(xì)胞生物功能，因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接的正常穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞存活直接相關(guān)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間的適當(dāng)間隔和離子轉(zhuǎn)運對細(xì)胞正常功能至關(guān)重要[23-24]。

4 2B蛋白通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細(xì)胞凋亡

4.1Ca2+與細(xì)胞凋亡的關(guān)系 細(xì)胞凋亡是由各種刺激引起的細(xì)胞死亡過程，該過程通過兩個途徑實現(xiàn)：①外源性途徑，激活細(xì)胞表面的死亡受體Fas或CD95；②內(nèi)源性途徑，包括線粒體膜通透性增加和ERS的發(fā)生。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，CVB3感染后直接觸發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞，使細(xì)胞外Ca2+大量涌入致線粒體內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9,14]。從生理功能控制到死亡程序的轉(zhuǎn)換均涉及Ca2+的嚴(yán)格調(diào)控或細(xì)胞器Ca2+水平的改變，因此破壞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)即可通過凋亡或壞死途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25]。

4.22B蛋白通過激活ERS影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的凋亡 在CVB3感染的細(xì)胞中，2B蛋白與Ca2+水平變化密切相關(guān)。CVB3產(chǎn)生的2B蛋白可使被感染細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的Ca2+外流，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的Ca2+水平降低，同時導(dǎo)致線粒體攝取Ca2+減少[6,9-10]。2B蛋白是通過內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，這種途徑包括ERS和線粒體途徑[6]。多種內(nèi)外環(huán)境刺激(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+代謝紊亂)均可引起ERS并激活未折疊蛋白反應(yīng)，進(jìn)而啟動一系列下游信號，對蛋白合成與降解比例進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)；但持續(xù)或過度的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被釋放入細(xì)胞質(zhì)則會刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的鈣調(diào)蛋白分解酶作用于胱天蛋白酶12，使之活化并釋放入細(xì)胞質(zhì)，激活相關(guān)的凋亡信號通路[26-27]。

4.32B蛋白通過減少線粒體Ca2+吸收影響線粒體途徑的凋亡 線粒體內(nèi)Ca2+水平過度升高是高細(xì)胞毒性的，過量的Ca2+負(fù)荷可導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開、線粒體滲透腫脹和外膜破裂以及細(xì)胞色素C等促凋亡因子釋放，這也是導(dǎo)致線粒體途徑細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵原因[6,28]。有研究提出了一種可能機制，即宿主細(xì)胞凋亡信號經(jīng)促分裂原活化的蛋白激酶通路傳遞給線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素C被釋放并作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的IP3Rs，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放入線粒體的Ca2+增加，直至達(dá)到線粒體內(nèi)的Ca2+超載，但當(dāng)2B蛋白插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的Ca2+大量外流入細(xì)胞質(zhì)，通過IP3Rs通路進(jìn)入線粒體的Ca2+反而減少，從而抑制線粒體通路的細(xì)胞凋亡[28]。CVB3感染后，凋亡程序立即在細(xì)胞中啟動，但在病毒感染的中期，細(xì)胞凋亡突然停止，表明細(xì)胞凋亡被部分抑制或延遲[25]。2B蛋白抑制線粒體途徑的凋亡反應(yīng)，為病毒基因組的復(fù)制提供了所需的時間，保證了病毒的成功復(fù)制與繁衍，由此可見，2B蛋白抑制細(xì)胞凋亡在CVB3的繁殖性感染中占有主導(dǎo)地位[9,25]。

4.42B蛋白通過抑制細(xì)胞凋亡為病毒復(fù)制提供時間 2B蛋白的主要功能就是為病毒的復(fù)制提供時間。①2B蛋白可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的Ca2+水平降低，進(jìn)而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體產(chǎn)生的囊泡的轉(zhuǎn)運功能，抑制宿主細(xì)胞的抗病毒免疫應(yīng)答；同時，也可導(dǎo)致囊泡積聚在細(xì)胞質(zhì)中，為病毒RNA復(fù)制提供場所[6,18]。②2B蛋白可暫時性阻斷線粒體凋亡途徑，為病毒RNA復(fù)制提供時間，但CVB3感染晚期，宿主細(xì)胞的凋亡依然會恢復(fù)，因此在宿主細(xì)胞中會出現(xiàn)成熟的凋亡信號，這是由于線粒體膜的通透性或勢能受到破壞，最終導(dǎo)致被感染的細(xì)胞死亡，從而使病毒后代能夠離開宿主細(xì)胞，釋放已組裝好的病毒，進(jìn)行下一輪的感染[14,28]。

2B蛋白一方面可激活ERS，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡，另一方面可抑制線粒體途徑凋亡，但這兩者間的復(fù)雜關(guān)系目前尚未完全明確。2B蛋白在病毒感染早期可抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，還可破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)造成ERS，而長期或過度的ERS可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。在ERS的早期階段，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體接觸的數(shù)量增加，以此來調(diào)節(jié)線粒體的代謝以幫助細(xì)胞度過應(yīng)激狀態(tài)，因此2B蛋白對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的不同影響可能在感染時間方面存在差異[7,26]。有研究者在海拉細(xì)胞和感染CVB3的小鼠中轉(zhuǎn)染2B蛋白的短發(fā)夾RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2B蛋白的短發(fā)夾RNA對海拉細(xì)胞中的病毒具有顯著的抑制作用，同時小鼠的存活率顯著提高、病毒組織的滴度降低、組織損傷減輕[29]?？梢?，2B蛋白對于宿主細(xì)胞更多的是一種負(fù)性作用，因此沉默CVB3 2B蛋白的基因是治療CVB3感染的有效靶點。

5 靶向2B蛋白的潛在治療方向

目前，針對2B蛋白的治療思路主要包括：①2B蛋白的基因與結(jié)構(gòu)特點均已明確，因此對其進(jìn)行特異性標(biāo)志與檢測可作為病毒性心肌炎的一種篩查手段[6]。②在靶向病毒孔蛋白的藥物中篩選抗小RNA病毒藥物是一種可行的方法，目前有4種類型的病毒孔蛋白抑制劑具有活性，包括金剛烷、阿米洛利、烷基亞胺糖和螺旋胺，但還需進(jìn)一步的詳細(xì)調(diào)查和藥物篩選[6,30]。③對互補信使RNA的特異性降解可被小干擾RNA或折疊的短發(fā)夾RNA觸發(fā)，該技術(shù)已應(yīng)用于多種疾病的治療及藥物研發(fā)中[6,29,31]。④2B蛋白是腸道病毒屬共有的一類非結(jié)構(gòu)蛋白，因此針對2B蛋白的有效治療可能擴大抗病毒治療策略的范圍[8,10]。

6 小 結(jié)

CVB3感染宿主心肌細(xì)胞后，作為一種病毒蛋白2B蛋白可干擾宿主細(xì)胞膜的穩(wěn)定、擾亂細(xì)胞器離子穩(wěn)態(tài)、損害細(xì)胞正常生理功能，最重要的是其可通過控制宿主細(xì)胞凋亡的進(jìn)程支持病毒生命周期的順利完成。因此，2B蛋白可作為CVB3心肌炎的一個潛在治療靶點。雖然目前對2B蛋白的研究相對較少，但2B蛋白疏水性和膜拓?fù)涞亩鄻踊约疤厥獾腣iroporin活性，均可為抗CVB3感染的病毒性心肌炎的干擾治療提供新思路[6,8,30]。目前2B蛋白在心肌炎細(xì)胞凋亡中的作用和具體機制已逐漸清晰，未來可通過對2B蛋白的干擾實現(xiàn)對CVB3感染進(jìn)程的控制，從而減輕CVB3對病毒性心肌炎患者心肌細(xì)胞的直接損傷。