綠鰭?cǎi)R面鲀爛嘴癥致病菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

英娜 王元 唐成婷 秦搏 楊立國(guó) 宋學(xué)鋒 郝志軍 高建民 吳艷慶

(1中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2平邑縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東臨沂 273300；3煙臺(tái)海關(guān)技術(shù)中心，山東煙臺(tái) 264000)

綠鰭?cǎi)R面鲀(Thamnaconusmodestus)隸屬于鲀形目(Tetraodontiformes)、單角鲀科(Monacanthidae)、馬面鲀屬(Thamnaconus)，又稱扒皮魚、耗兒魚等[1-2]。因其肉質(zhì)鮮美，富含人體必需氨基酸及不飽和脂肪酸[3]而深受消費(fèi)者的喜愛。近年來，隨著捕撈生產(chǎn)的加劇，野生綠鰭?cǎi)R面鲀的資源量急劇下降。為了滿足市場(chǎng)需求，國(guó)內(nèi)多地開展了綠鰭?cǎi)R面鲀工廠化養(yǎng)殖。尤其2011年人工繁育技術(shù)突破以后[4]，綠鰭?cǎi)R面鲀工廠化養(yǎng)殖產(chǎn)量越來越高。然而對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物而言，養(yǎng)殖密度的加大也意味著患病風(fēng)險(xiǎn)的增加。

2019年夏季，江蘇連云港地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)有部分養(yǎng)殖綠鰭?cǎi)R面鲀因嘴部皮膚潰爛、影響進(jìn)食而死亡。鏡檢病灶及鰓、鰭部未發(fā)現(xiàn)寄生蟲，但是從病灶處分離出大量單一性狀的菌落。為確定病灶優(yōu)勢(shì)菌的菌種信息，探明此菌與養(yǎng)殖綠鰭?cǎi)R面鲀發(fā)病的關(guān)系，本研究進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定工作，并針對(duì)此菌株開展了相關(guān)的藥敏試驗(yàn)，以期為該病的治療及預(yù)防提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用綠鰭?cǎi)R面鲀來自江蘇連云港某養(yǎng)殖場(chǎng)，為15個(gè)月齡魚。挑選典型的具有爛嘴、魚體偏瘦、體色發(fā)黑癥狀的瀕死魚作為試驗(yàn)材料(見圖1)。Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)、TCBS弧菌選擇性培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Mix 預(yù)混液購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

圖1 健康(a)與發(fā)病(b)綠鰭?cǎi)R面鲀的嘴部Fig.1 The healthy(a)and diseased(b) mouth of T. modestus

1.2 組織處理和病原菌的純化

取瀕死病魚的嘴部潰爛組織，鏡檢觀察是否有寄生蟲。用75%酒精對(duì)潰爛組織進(jìn)行表面消毒處理后，采用滅菌紙巾吸干表面水分。將以上組織剪碎、勻漿、稀釋處理，吸取100 μL勻漿稀釋液接種于直徑為90 mm的LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)20 h后，將優(yōu)勢(shì)菌落再次劃線分離培養(yǎng)，蘸取少量純化菌于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.3 病原菌分子鑒定及序列分析

將再純化的菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌16～20 h(恒溫?fù)u床：28 ℃，150 r/min)。并將一部分菌液加入甘油凍存留種，另一部分菌液離心清洗后，按照DNA提取試劑盒說明書的流程進(jìn)行基因組DNA的提取。使用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR核酸擴(kuò)增，通用引物序列為：27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μL(包括1 μL DNA 模板，12.5 μL 2×TaqPCR Mix，10.5 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增程序(94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s)，最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將擴(kuò)增出目標(biāo)條帶(1 500 bp左右)的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)，并進(jìn)行BLAST(basic local alignment search tool)比較，選取比對(duì)結(jié)果中相似性排名前10的序列作為待測(cè)菌株參考，通過鄰接法(neighbour-joining，NJ)構(gòu)建目標(biāo)菌株與相似性序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 人工回感試驗(yàn)

選擇健康綠鰭?cǎi)R面鲀(15個(gè)月齡左右，體長(zhǎng)8.2～10.4 cm)為感染對(duì)象。將甘油冷凍保存的目標(biāo)菌株進(jìn)行LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，并制備一系列濃度梯度稀釋的菌懸液，注射到健康魚體內(nèi)，注射量為200 μL/尾，并以同樣體積的生理鹽水作為對(duì)照組注射液。注射后的綠鰭?cǎi)R面鲀分別飼養(yǎng)于流水(日換水量為200%)、充氣的玻璃鋼魚缸內(nèi)，水溫約為18 ℃。1周后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)用魚的癥狀率和死亡率。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

選取不同類型抗生素的代表藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取100 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液均勻涂抹到LB平板上，晾干后，分別取不同藥敏片置于平板上，倒扣放置。24 h后統(tǒng)計(jì)不同藥物抑菌圈的大小，并以抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來判斷其敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病原菌觀察及分子鑒定結(jié)果

將病灶組織分離出的優(yōu)勢(shì)菌命名為QZG3。此菌株在TCBS選擇培養(yǎng)基上的形態(tài)為：綠色，圓形，黏稠狀(見圖2)，在顯微鏡下可觀察到QZG3菌株形狀短小，長(zhǎng)度0.8～2.1 μm；經(jīng)革蘭氏染色，判斷QZG3菌株為革蘭氏陰性菌。同時(shí)QZG3菌株的16S rDNA序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST比對(duì)，結(jié)果表明，此菌株與弧菌屬相似性達(dá)99%～100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，該菌株與阿爾法克弧菌(Vibrioalfacsensis)聚為1支(見圖3)，因此判斷該菌株為阿爾法克弧菌。

圖2 病原菌的形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of pathogenic bacteria

2.2 人工回感試驗(yàn)結(jié)果

QZG3菌株對(duì)健康綠鰭?cǎi)R面鲀的人工回感試驗(yàn)結(jié)果見表1(統(tǒng)計(jì)周期為7 d)。注射QZG3菌株組綠鰭?cǎi)R面鲀的累計(jì)死亡率為10%～30%，出現(xiàn)癥狀率為30%～90%，對(duì)照組(注射生理鹽水)則未出現(xiàn)死亡情況和爛嘴癥狀。從感染再發(fā)病魚的組織中分離出的優(yōu)勢(shì)菌株與QZG3表面形態(tài)一致，因此推斷QZG3菌株為綠鰭?cǎi)R面鲀爛嘴癥的致病菌株。

表1 不同濃度的QZG3菌株對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀的毒力測(cè)定結(jié)果Tab.1 Toxicity test results of different concentrations of QZG3 strains to T. modestus

2.3 藥敏試驗(yàn)

QZG3菌株對(duì)10種抗生素的敏感性結(jié)果見表2。結(jié)果表明，QZG3菌株對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感，對(duì)土霉素、青霉素、頭孢氨芐、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素和紅霉素表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)新霉素中度敏感。

表2 菌株QZG3的藥敏特性Tab.2 Drug sensitivity of strain QZG3

3 討論

皮膚潰爛是常見的養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性疾病之一，主要表現(xiàn)為爛嘴、爛尾、爛鰭等癥狀，其中爛嘴癥不容小覷?；驾p度爛嘴癥的個(gè)體由于影響正常攝食而出現(xiàn)體形消瘦、腸炎等癥狀，嚴(yán)重患病個(gè)體則會(huì)出現(xiàn)體表大面積潰爛，甚至病原菌從傷口進(jìn)入血液從而引發(fā)菌血癥。魚類皮膚潰爛大多由弧菌[5-6]或者氣單胞菌[7]引起?；【撬a(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中常見的致病菌，如引起凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合征的副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)[8-9]、引起赤魚工皮膚潰爛的創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)[5]、引起林蛙爛嘴病的解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus)[10]等。夏季水溫較高，正是弧菌疾病的高發(fā)期。

注：括號(hào)中為菌株的GenBank登錄號(hào)。Note:the GenBank login number of the strain is in parentheses.圖3 通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株QZG3及相關(guān)菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of strain QZG3 and related bacteria was constructed by Neighbor-joining method

本研究發(fā)現(xiàn)，綠鰭?cǎi)R面鲀爛嘴癥的致病菌為阿爾法克弧菌。此前未見相關(guān)的研究報(bào)道，這可能與此菌的宿主特異性有關(guān)。另一方面，國(guó)內(nèi)關(guān)于綠鰭?cǎi)R面鲀的研究集中在養(yǎng)殖[11-12]、繁育[13]等方面，對(duì)細(xì)菌性疾病的研究相對(duì)較少。

目前我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)存在因長(zhǎng)期、過量使用抗生素而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加、水產(chǎn)品中抗生素殘留超標(biāo)和養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素污染等問題，已嚴(yán)重影響我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[14]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，綠鰭?cǎi)R面鲀爛嘴癥的致病菌——阿爾法克弧菌已經(jīng)對(duì)土霉素、青霉素、紅霉素、頭孢氨芐、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素等表現(xiàn)出耐藥性，說明養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中存在使用抗生素不規(guī)范現(xiàn)象。因此，在今后的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，應(yīng)該科學(xué)、規(guī)范地使用抗生素，非必須情況下避免使用，必須情況下也應(yīng)該避免長(zhǎng)期或者過量使用同一種抗生素。