中華絨螯蟹幼體及仔蟹階段肝胰腺發(fā)育的組織學(xué)研究

李住 陸錦天 劉智俊

(上海市水產(chǎn)研究所，上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、大閘蟹，是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蟹類。隨著河蟹養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，苗種需求量也逐漸增大，從而促進(jìn)了河蟹人工育苗技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟。有關(guān)河蟹胚胎和幼體發(fā)育的研究已屢見報(bào)道，從幼體生態(tài)[1]、器官發(fā)生[2-3]、生化組成[4-5]、酶活變化[6]、超微結(jié)構(gòu)[7]等基礎(chǔ)性的研究，到食性分析[8-9]、營(yíng)養(yǎng)需求[10-12]、苗種質(zhì)量評(píng)估[13]、投喂模式[14]等與育苗生產(chǎn)息息相關(guān)的應(yīng)用性研究，為河蟹產(chǎn)業(yè)提供了豐富的理論支撐。

甲殼類動(dòng)物由卵黃提供整個(gè)胚胎發(fā)育階段所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且隨著胚胎發(fā)育末期卵黃物質(zhì)逐步消耗殆盡，卵黃囊特化為肝胰腺前體，幼體營(yíng)養(yǎng)模式也由內(nèi)源性轉(zhuǎn)為外源性，并隨著胚胎孵化和幼體發(fā)育逐步形成肝胰腺[15]，即由最初的雙囊狀結(jié)構(gòu)逐漸分化為多管狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞從單一柱狀上皮細(xì)胞進(jìn)一步分化為有特定功能的4種肝胰腺細(xì)胞[16-17]。中華絨螯蟹也是如此。目前對(duì)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育后期至幼體生長(zhǎng)階段肝胰腺發(fā)育的研究報(bào)道較少。本研究通過組織學(xué)和免疫組化方法研究了中華絨螯蟹胚胎發(fā)育末期至仔蟹Ⅲ期卵黃囊消失及肝胰腺發(fā)育的時(shí)間節(jié)點(diǎn)及形態(tài)特征變化，探索肝胰腺早期發(fā)育模式，旨在豐富中華絨螯蟹幼體發(fā)育生物學(xué)理論，為其幼體早期的培育生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用蟹養(yǎng)殖及樣品采集

試驗(yàn)用中華絨螯蟹親本在上海海洋大學(xué)如東河蟹育苗實(shí)驗(yàn)基地開展強(qiáng)化培育。于2018年12月22日挑選肢體健全、性腺發(fā)育良好的6只雌蟹和3只雄蟹轉(zhuǎn)移到雙層PVC桶(直徑1.0 m，高1.2 m)內(nèi)。桶底部鋪設(shè)10 cm厚黃沙，水深70 cm，水體鹽度為15。雌蟹和雄蟹在桶內(nèi)自行交配，1周后，將雄蟹移出以避免影響雌蟹產(chǎn)卵。2018年12月29日至2019年1月2日，雌蟹陸續(xù)抱卵，使用標(biāo)簽對(duì)各抱卵雌蟹進(jìn)行編號(hào)，并記錄每只雌蟹開始抱卵的時(shí)間，以便之后進(jìn)行胚胎連續(xù)跟蹤采樣。每天16:00投喂足量的新鮮縊蟶，次日上午清除殘餌，并用新鮮海水更換桶內(nèi)30%～50%水體。雌蟹親本抱卵后，每天從親本蟹體上取卵粒置于解剖鏡下觀察胚胎發(fā)育情況。中華絨螯蟹胚胎發(fā)育共分為7期：Ⅰ(受精卵)，Ⅱ(卵裂期)，Ⅲ(囊胚期)，Ⅳ(原腸期)，Ⅴ(眼點(diǎn)期)，Ⅵ (色素期)，Ⅶ(心跳期)。當(dāng)胚胎發(fā)育至心跳期時(shí)開始采集心跳期胚胎及后續(xù)孵化出的溞狀幼體Ⅰ～Ⅴ期(Z1～Z5)和大眼幼體期(M)樣品。

大眼幼體階段采樣完成后，將剩余的大眼幼體進(jìn)行淡化處理并轉(zhuǎn)移至上海海洋大學(xué)崇明基地繼續(xù)養(yǎng)殖。試驗(yàn)塘的規(guī)格為7.8 m×7.8 m×0.7 m(長(zhǎng)×寬×高)，四周設(shè)置雙層防逃塑料板，池塘中種植水花生，定期采樣觀察大眼幼體的變態(tài)發(fā)育情況，并分別采集仔蟹Ⅰ～Ⅲ期(J1～J3)樣品。所有樣品用伯恩氏液固定24 h后保存于70%的酒精中，用于后續(xù)的組織學(xué)及免疫組化分析。

1.2 蘇木精-伊紅染色

蘇木精-伊紅染色(HE染色)：所有樣品采用酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋(56～58 ℃)，使用科迪KD-2258型切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為5.0～6.0 μm，石蠟切片經(jīng)梯度酒精脫蠟至水，浸入蘇木精染色25 min，鹽酸酒精分色，自來水流水沖洗30 min進(jìn)行返藍(lán)，經(jīng)80%酒精5 min，90%酒精5 min后浸入伊紅染色1 min，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，采用尼康顯微鏡觀察拍照。

1.3 免疫組織化學(xué)

石蠟切片經(jīng)梯度酒精脫蠟至水，滴加3% H2O2，室溫孵育20 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.2～7.6)沖洗5 min×3次，用枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù)，水浴加熱94 ℃，40 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加5% BSA封閉非特異性抗原，室溫孵育30 min，傾去血清，滴加小鼠抗中華絨螯蟹卵黃磷蛋白單克隆抗體(工作濃度1∶200)，4 ℃過夜。次日，用PBS沖洗5 min×3次，滴加多聚體抗小鼠IgG-HRP，37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，用尼康顯微鏡觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Image pro plus 6.0軟件分析顯微照片，對(duì)中華絨螯蟹幼體肝胰腺上皮細(xì)胞高度進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)樣品測(cè)定30個(gè)細(xì)胞。所有數(shù)據(jù)采用：“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)不滿足齊性方差時(shí)對(duì)百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或者平方根處理，用ANOVA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，設(shè)P<0.05為差異顯著。在EXCEL上繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 中華絨螯蟹溞狀幼體肝胰腺發(fā)育組織學(xué)觀察

中華絨螯蟹溞狀幼體肝胰腺的發(fā)育情況詳見表1和圖1、圖2。雌蟹抱卵后20 d，胚胎發(fā)育進(jìn)入原腸期。隨著細(xì)胞的進(jìn)一步分裂，透明區(qū)形成細(xì)胞密集區(qū)域，稱為胚區(qū)，胚區(qū)后端形成原口，這是未來幼體胸腹部發(fā)生區(qū)域。此區(qū)域逐步發(fā)育向卵黃內(nèi)部延伸，稱為內(nèi)胚層細(xì)胞，而原有的囊胚層細(xì)胞則發(fā)育成外胚層。內(nèi)胚層細(xì)胞不斷吸收卵黃物質(zhì)向內(nèi)生長(zhǎng)，另一部分內(nèi)胚層細(xì)胞則移到胸腹部發(fā)生區(qū)域沿外側(cè)生長(zhǎng)，兩者逐步延伸形成包裹狀結(jié)構(gòu)，將卵黃區(qū)環(huán)繞，中華絨螯蟹卵黃囊結(jié)構(gòu)初步形成。隨后，隨著胚胎的發(fā)育，卵黃物質(zhì)逐步消耗，卵黃囊逐漸縮小。當(dāng)胚胎發(fā)育至心跳后期(抱卵后93 d)，心跳速度加快，胚胎即將孵化。外觀可見，胚胎近乎透明，眼點(diǎn)發(fā)育完全，卵黃囊為對(duì)稱斑塊(圖1-1)。組織學(xué)觀察顯示，卵黃囊中尚有卵黃物質(zhì)(圖1-2，YG)，其中已出現(xiàn)較多空隙，卵黃囊壁增厚(圖1-2，HR)，中腸從中穿過(圖1-3，G)，已能分辨出含大量泡狀結(jié)構(gòu)的柱狀上皮細(xì)胞(圖1-3，HR)，此時(shí)可認(rèn)為肝胰腺前體已經(jīng)形成，但此時(shí)柱狀上皮細(xì)胞高度僅為(14.38±2.67)μm，尚無(wú)功能分化。

表1 中華絨螯蟹幼體及仔蟹肝胰腺發(fā)育情況Tab.1 Hepatosomatic development of larval and juvenile E. sinensis

雌蟹抱卵后96 d，胚胎孵化，Ⅰ期溞狀幼體出膜。幼體全長(zhǎng)(1 737±80)μm，呈三角形，分為頭胸甲和尾節(jié)兩部分，其中第二顎足末端具4根剛毛，為本期幼體重要分類依據(jù)。頭胸甲半透明，肝胰腺區(qū)域清晰可見，呈橘黃色(圖1-4)。組織學(xué)觀察顯示，此時(shí)肝胰腺為1對(duì)囊狀結(jié)構(gòu)(圖1-5，H)，位于胸神經(jīng)節(jié)和中腸兩側(cè)(圖1-6，TG、G)，除了不含卵黃物質(zhì)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)與孵化前心跳期胚胎中的肝胰腺前體基本一致(圖1-6，H)，肝胰腺細(xì)胞高度略有降低，為(12.63±4.91)μm。

胚胎孵化后3 d，Ⅰ期溞狀幼體蛻殼成為Ⅱ期溞狀幼體，幼體全長(zhǎng)(1 978±187)μm，幼體眼柄出現(xiàn)，第二顎足末端具6根剛毛。肝胰腺位于頭胸甲中部，外觀可見細(xì)密脂滴(圖1-7)。Ⅱ期溞狀幼體縱切組織學(xué)顯示，肝胰腺依然以囊狀結(jié)構(gòu)為主體，但前后明顯拉長(zhǎng)，此時(shí)肝胰腺前端已開始分葉，向復(fù)眼方向分上、下兩葉，左右對(duì)稱(圖1-8，H)，Ⅱ期溞狀幼體平切組織學(xué)顯示，肝胰腺向后尚未分葉，此時(shí)肝胰腺為“前四后二”的六葉結(jié)構(gòu)(圖1-8，H)。肝胰腺細(xì)胞平均高度為(28.56±7.51)μm，首次能分辨出帶空泡的B細(xì)胞(圖1-8，BC)，以及在肝胰腺小葉尖端的E細(xì)胞(圖1-9，EC)。

胚胎孵化后6 d，Ⅱ期溞狀幼體蛻殼成為Ⅲ期溞狀幼體，幼體全長(zhǎng)(2 954±243)μm，第二顎足具有8根剛毛，肝胰腺區(qū)域明顯增大，其中脂滴顆粒大小不一(圖1-10)。Ⅲ期溞狀幼體組織學(xué)縱切顯示，肝胰腺前端依舊為兩葉，后端也開始分為上、下兩葉，E細(xì)胞分布于小葉尖端(圖1-11，EC)，且近尖端區(qū)域囊狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步拉長(zhǎng)開始轉(zhuǎn)為管狀結(jié)構(gòu)。Ⅲ期溞狀幼體組織學(xué)平切顯示，肝胰腺中B細(xì)胞數(shù)量增多(圖1-12，BC)，且首次出現(xiàn)了強(qiáng)嗜堿性的F細(xì)胞(圖1-12，F(xiàn)C)，肝胰腺細(xì)胞平均高度為(32.78±10.68)μm，此時(shí)肝胰腺為“前四后四”的八葉結(jié)構(gòu)。

胚胎孵化后8 d，Ⅲ期溞狀幼體蛻殼成為Ⅳ期溞狀幼體，幼體全長(zhǎng)(3 821±203)μm，第二顎足具有10根剛毛。肝胰腺區(qū)域向后延伸至頭胸甲末端(圖1-13)。Ⅳ期溞狀幼體組織學(xué)縱切顯示，肝胰腺已充滿整個(gè)頭胸甲(圖1-14，H)，前端四葉結(jié)構(gòu)每葉進(jìn)一步分出兩葉，后端維持不變，放大顯示，肝胰腺中具有發(fā)達(dá)的B細(xì)胞，E細(xì)胞依然分布于盲端(圖1-15，BC、EC)，此時(shí)肝胰腺細(xì)胞平均高度為(40.74±13.70)μm，肝胰腺為“前八后四”的十二葉結(jié)構(gòu)。

胚胎孵化后12 d，Ⅳ期溞狀幼體蛻殼成為Ⅴ期溞狀幼體，幼體全長(zhǎng)(4 901±342)μm，第二顎足具有12根剛毛。Ⅴ期溞狀幼體組織學(xué)縱切顯示，肝胰腺中脂滴豐富，存在大量空泡狀結(jié)構(gòu)(圖1-16)，肝胰腺小葉數(shù)量與上一期幼體一致，已經(jīng)出現(xiàn)了真正意義上的管狀結(jié)構(gòu)(圖1-17，H)，不僅出現(xiàn)了由E細(xì)胞圍繞而成的肝胰腺盲端(圖1-17，EC)，還首次出現(xiàn)了與成蟹肝胰腺相似的星形管狀結(jié)構(gòu)(圖1-18，H)，肝胰腺細(xì)胞平均高度為(44.16±13.57)μm。

2.2 中華絨螯蟹大眼幼體及仔蟹肝胰腺發(fā)育組織學(xué)觀察

胚胎孵化后15 d，Ⅴ期溞狀幼體蛻殼成為大眼幼體，幼體全長(zhǎng)(5 382±377)μm，體形扁平，有額刺結(jié)構(gòu)，背刺、側(cè)刺及尾叉結(jié)構(gòu)均消失，復(fù)眼發(fā)達(dá)，胸足5對(duì)，第一對(duì)為大螯，呈鉗狀。大眼幼體肝胰腺組織學(xué)顯示，肝胰腺呈星芒狀向四周擴(kuò)散(圖2-1，H)，腸道中有食物(圖2-2，G)。大眼幼體肝胰腺中有F、B、E 3種細(xì)胞，B細(xì)胞中有待消化物質(zhì)，E細(xì)胞只出現(xiàn)在肝小管盲端和新突起的盲囊上(圖2-2，F(xiàn)C、BC、EC)，在肝小管中已發(fā)現(xiàn)脫落的內(nèi)皮，且從肝小管上有較多盲囊狀突起向外生長(zhǎng)(圖2-3，CA)，這些盲囊狀突起將發(fā)育為新的肝小管，此時(shí)僅憑組織學(xué)觀察已無(wú)法明確肝小管的數(shù)量。肝胰腺細(xì)胞平均高度為(44.93±18.27)μm。

1.心跳期胚胎外觀；2.心跳期胚胎縱切組織學(xué)(附圖：肝胰腺前體細(xì)胞放大)；3.心跳期胚胎橫切組織學(xué)；4.I期溞狀幼體外觀；5.I期溞狀幼體縱切組織學(xué)；6.I期溞狀幼體平切；7.Ⅱ期溞狀幼體外觀；8.Ⅱ期溞狀幼體縱切組織學(xué)；9.Ⅱ期溞狀幼體平切組織學(xué)；10.Ⅲ期溞狀幼體外觀；11.Ⅲ期溞狀幼體縱切組織學(xué)；12.Ⅲ期溞狀幼體平切組織學(xué)；13.Ⅳ期溞狀幼體外觀；14.Ⅳ期溞狀幼體縱切組織學(xué)；15.Ⅳ期溞狀幼體縱切組織學(xué)放大；16.Ⅴ期溞狀幼體外觀；17.Ⅴ期溞狀幼體縱切組織學(xué)；18.Ⅴ期溞狀幼體縱切組織學(xué)放大。YG：卵黃物質(zhì)；HR：肝胰腺前體；H：肝胰腺；G：腸道;TG：胸神經(jīng)節(jié);BC:B細(xì)胞;FC:F細(xì)胞;EC:E細(xì)胞;E:復(fù)眼。1.external appearance of protozoea;2.slitter histology of protozoea;3.transection histology of protozoea;4.external appearance of Zoea Ⅰ;5.slitter histology of Zoea Ⅰ;6.truncation histology of Zoea Ⅰ;7.external appearance of Zoea Ⅱ;8.slitter histology of Zoea Ⅱ;9.truncation histology of Zoea Ⅱ;10.external appearance of Zoea Ⅲ;11.slitter histology of Zoea Ⅲ;12.truncation histology of Zoea Ⅲ;13.external appearance of Zoea Ⅳ;14.slitter histology of Zoea Ⅳ;15.slitter histology of Zoea Ⅳ;16.external appearance of Zoea Ⅴ;17.slitter histology of Zoea Ⅴ;18.slitter histology of Zoea Ⅴ.YG:Yolk;HR:prohepatopancreas;H:hepatopancreas;G:gut;TG:ganglia thoracalia;BC:B cell;FC:F cell;EC:E cell；E：compound eyes.圖1 中華絨螯蟹晚期胚胎及溞狀幼體階段肝胰腺組織學(xué)切片F(xiàn)ig.1 Hepatosomatic histology of embryo and zoea of the E. sinensis

1.大眼幼體縱切組織學(xué)；2.大眼幼體單側(cè)肝胰腺平切；3.大眼幼體肝胰腺組織學(xué)放大；4.Ⅰ期仔蟹平切；5.Ⅰ期仔蟹肝小管組織學(xué)；6.早期R細(xì)胞組織學(xué)；7.Ⅱ期仔蟹平切組織學(xué)；8.Ⅱ期仔蟹肝小管組織學(xué)；9.Ⅱ期仔蟹R細(xì)胞組織學(xué)；10.Ⅲ期仔蟹平切組織學(xué)；11.Ⅲ期仔蟹肝小管組織學(xué)；12.Ⅲ期仔蟹肝小管組織學(xué)放大。H：肝胰腺；G：腸道；CA：肝胰腺盲囊；Gi：鰓；RC：R細(xì)胞；TG：胸神經(jīng)節(jié)；BC：B細(xì)胞；FC:F細(xì)胞;EC:E細(xì)胞。1.slitter histology of megalopa;2.truncation histology of megalopa hepatopancreas;3.truncation histology of megalopa hepatopancreas;4.truncation histology of stage Ⅰ juvenile;5.hepatopancreas histology of stage Ⅰ juvenile;6.histology of early stage R cells;7.truncation histology of stage Ⅱ juvenile;8.hepatopancreas histology of stage Ⅱ juvenile;9.histology of juvenile stage Ⅱ R cells;10.truncation histology of stage Ⅲ juvenile;11.hepatopancreas histology of stage Ⅲ juvenile;12.hepatopancreas histology of stage Ⅲ juvenile(zoom in).H：hepatopancreas;G：gut;CA：Hepatopancreas caecum;Gi:gill;RC：R cell;TG:ganglia thoracalia;BC：B cell;FC:F cell;EC:E cell.圖2 中華絨螯蟹大眼幼體及仔蟹階段肝胰腺組織學(xué)切片F(xiàn)ig.2 Hepatosomatic histology of megalopa and juvenile E. sinensis

大眼幼體經(jīng)11 d后蛻殼成Ⅰ期仔蟹。組織學(xué)觀察可見，此時(shí)肝胰腺與肌肉、鰓處于同一平面(圖2-4，H、Mu、Gi)，除了F、B、E 3種細(xì)胞外，肝小管形態(tài)接近圓形，與成蟹相似(圖2-5，H)。首次出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)中含有細(xì)小空泡的細(xì)胞(圖2-6，RC)，可能為R細(xì)胞的前體，肝胰腺細(xì)胞高度為(53.09±12.27)μm。

Ⅰ期仔蟹經(jīng)7 d后蛻殼成為Ⅱ期仔蟹。組織學(xué)觀察可見，肝胰腺位于頭胸甲中部(圖2-7，H)，肝胰腺橫截面均呈多角星形結(jié)構(gòu)(圖2-8，H)，肝胰腺細(xì)胞高度為(55.70±10.75)μm，F(xiàn)、B、R、E 4種細(xì)胞齊全，R細(xì)胞中充滿細(xì)密脂滴，形態(tài)結(jié)構(gòu)已與成蟹無(wú)異(圖2-9，RC)，預(yù)示著自此階段開始，中華絨螯蟹肝胰腺除了進(jìn)一步繼續(xù)發(fā)育增加肝小管數(shù)量外，其功能已基本完善。B細(xì)胞比例的提升及其頂泡中的未消化物質(zhì)表明，Ⅱ期仔蟹相比之前階段的幼體和I期仔蟹已有較強(qiáng)的吸收能力，而R細(xì)胞中密集出現(xiàn)的空泡則表明肝胰腺已有一定儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力。

Ⅱ期仔蟹經(jīng)6 d后蛻殼成為Ⅲ期仔蟹，肝小管數(shù)量進(jìn)一步增多，延伸至頭胸甲內(nèi)各個(gè)位置，圍繞于肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、腸道(圖2-10，Mu、TG、G)，肝胰腺結(jié)構(gòu)與Ⅱ期仔蟹無(wú)異(圖2-12，BC、RC)，肝胰腺細(xì)胞高度為(56.38±5.69)μm。

1.囊胚期胚胎卵黃磷蛋白免疫組化；2.原腸期胚胎卵黃磷蛋白免疫組化；3.心跳期胚胎卵黃磷蛋白免疫組化；4.I期溞狀幼體卵黃磷蛋白免疫組化；5.Ⅳ期溞狀幼體卵黃磷蛋白免疫組化；6.大眼幼體卵黃磷蛋白免疫組化。*為卵黃磷蛋白免疫組化陽(yáng)性位點(diǎn)；HR：肝胰腺前體；H：肝胰腺；Gi：鰓；G：腸道。1.vitellin immunohistochemistry in blastula stage;2.vitellin immunohistochemistry in Gastrula stage;3.vitellin immunohistochemistry in protozoea;4.vitellin immunohistochemistry in Zoea Ⅰ;5.vitellin immunohistochemistry in Zoea Ⅳ;6.vitellin immunohistochemistry in megalopa.*vitellin immunohistochemistry positive material;HR：prohepatopancreas;H：hepatopancreas;Gi：gill；G：gut.圖3 中華絨螯蟹胚胎及幼體階卵黃磷蛋白免疫組化Fig.3 Vitellin immunohistochemistry in embryo and larval stage of E. sinensis

2.3 中華絨螯蟹胚胎發(fā)育末期、幼體卵黃磷蛋白免疫組化

卵黃磷蛋白是1種普遍存在于卵生非哺乳動(dòng)物血液中的雌性特異性蛋白，其作為載體蛋白進(jìn)入蟹類的卵母細(xì)胞，為胚胎和早期幼體提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通過免疫組化技術(shù)對(duì)中華絨螯蟹胚胎和幼體中的卵黃磷蛋白進(jìn)行定位，結(jié)果表明，胚胎發(fā)育到囊胚期和原腸期時(shí)，卵黃磷蛋白強(qiáng)陽(yáng)性位點(diǎn)均分布于卵黃囊內(nèi)，密集圍繞于卵黃島周圍(圖3-1、3-2)，當(dāng)胚胎發(fā)育至心跳期時(shí)，卵黃囊中已無(wú)卵黃磷蛋白強(qiáng)陽(yáng)性位點(diǎn)，僅在卵黃囊外周，圍繞肝胰腺前體細(xì)胞有弱陽(yáng)性位點(diǎn)(圖3-3，HR)。隨后胚胎孵化，卵黃磷蛋白陽(yáng)性位點(diǎn)消失，溞狀幼體和大眼幼體的肝胰腺區(qū)域均無(wú)發(fā)現(xiàn)(圖3-4、3-5、3-6)，表明中華絨螯蟹在胚胎發(fā)育中期是動(dòng)用卵黃磷蛋白的高峰期，而胚胎發(fā)育末期卵黃磷蛋白已消耗殆盡，初孵幼體已不帶有卵黃磷蛋白。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹幼體及仔蟹階段肝胰腺形態(tài)發(fā)育

當(dāng)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育至囊胚期后期時(shí)，一部分內(nèi)胚層細(xì)胞不斷吸收卵黃物質(zhì)向內(nèi)生長(zhǎng)，另一部分內(nèi)胚層細(xì)胞則移到胸腹部發(fā)生區(qū)域沿外側(cè)生長(zhǎng)，兩者逐步延伸形成包裹狀結(jié)構(gòu)將卵黃區(qū)環(huán)繞，形成卵黃囊結(jié)構(gòu)，此特征與三疣梭子蟹相似[15]。隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，卵黃囊中的卵黃物質(zhì)逐步消耗，卵黃囊體積逐步減小，當(dāng)胚胎發(fā)育到心跳期階段，中腸深入卵黃囊并從中穿過，將卵黃囊分割為兩個(gè)獨(dú)立腔體，且卵黃囊壁增厚，排列著一圈帶空泡結(jié)構(gòu)的柱狀上皮細(xì)胞。這兩對(duì)獨(dú)立腔體是幼體肝胰腺發(fā)育的基礎(chǔ)，可稱為肝胰腺前體，而由肝胰腺前體發(fā)育為真正意義上的肝胰腺，是1個(gè)相對(duì)連續(xù)的發(fā)育過程，主要包含兩個(gè)方面的要素：首先是從形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)為雙葉多管狀致密結(jié)構(gòu)，其次是肝胰腺中分化出形態(tài)特征明顯、各具重要功能的4種柱狀上皮細(xì)胞。以往的研究表明，在不同甲殼類動(dòng)物的肝胰腺發(fā)育過程中，肝小管的數(shù)量、長(zhǎng)度、形態(tài)變化及與幼體發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)的契合均有所不同，但發(fā)育規(guī)律均是隨著幼體的發(fā)育，肝胰腺的體積逐步增大，肝小管數(shù)目增多，肝胰腺細(xì)胞分化逐步完善。例如在三疣梭子蟹和鋸緣青蟹中，肝胰腺分葉均自溞狀幼體1期開始[16-17]，中國(guó)對(duì)蝦肝胰腺分葉自無(wú)節(jié)幼體4期至5期開始[18]，中國(guó)龍蝦肝胰腺分葉從葉狀幼體1期開始[19]。在本研究中，中華絨螯蟹肝胰腺分葉是從溞狀幼體Ⅱ期開始的。

3.2 中華絨螯蟹幼體及仔蟹階段肝胰腺細(xì)胞種類變化規(guī)律

甲殼動(dòng)物成熟肝胰腺中包含4種細(xì)胞，分別為E、F、R、B細(xì)胞，對(duì)于4種細(xì)胞的功能，在學(xué)術(shù)上已有較一致的結(jié)論[20-23]。E細(xì)胞主要分布于肝小管盲端，其排列致密，細(xì)胞核體積占比較大，HE染色呈強(qiáng)嗜堿性，為未分化的胚細(xì)胞，可分化為其他3種類型的細(xì)胞；F細(xì)胞HE染色也呈強(qiáng)嗜堿性，但呈高圓柱狀，胞核大而圓，核仁明顯，超微結(jié)構(gòu)研究表明，其胞質(zhì)有極為發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和豐富的游離核糖體，主要起合成糖原、蛋白酶原作用；B細(xì)胞主要以胞飲方式吸收營(yíng)養(yǎng)，兼具分泌功能，其最明顯的特征是含有巨大的頂泡結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)中還有小的分泌泡，泡內(nèi)含有少量細(xì)顆粒狀物可進(jìn)行胞內(nèi)消化。超微結(jié)構(gòu)研究表明，B細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，胞核呈圓形，具有1～2個(gè)核仁，位于核中央；R細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是胞質(zhì)內(nèi)含有較多細(xì)密的儲(chǔ)存物質(zhì)囊泡，囊泡多位于底部，易與B細(xì)胞的頂泡進(jìn)行區(qū)分。囊泡內(nèi)富含脂滴，其內(nèi)貯存有脂肪顆粒和糖原，超微結(jié)構(gòu)研究表明，R細(xì)胞內(nèi)可見游離的核糖體和吞噬泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器數(shù)量少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比較豐富，具有吸收、貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(脂肪、糖原)的功能。一般認(rèn)為E細(xì)胞分化有兩個(gè)方向，一個(gè)方向是由E細(xì)胞分化為F或B細(xì)胞，另一個(gè)方向是由E細(xì)胞分化為R細(xì)胞。在本研究中，中華絨螯蟹肝胰腺中E細(xì)胞和B細(xì)胞首先出現(xiàn)，其中E細(xì)胞始終出現(xiàn)在肝胰腺小葉的最尖端，表明其旺盛的生長(zhǎng)能力。B細(xì)胞自溞狀幼體Ⅱ期出現(xiàn)，且隨后在肝胰腺中一直占主導(dǎo)地位。與之相對(duì)的，R細(xì)胞出現(xiàn)最晚，直至Ⅱ期仔蟹才出現(xiàn)在肝胰腺中。十足目甲殼動(dòng)物的代謝模式均為自體營(yíng)養(yǎng)，孵化后，其體內(nèi)內(nèi)源性卵黃物質(zhì)較少，且包含多幼體階段變態(tài)發(fā)育，一般來說耐饑餓能力較差，存在饑餓脅迫的不可逆點(diǎn)。以往對(duì)中華絨螯蟹幼體的耐饑餓能力研究表明，中華絨螯蟹在Ⅰ期溞狀幼體階段，饑餓超過4 d后恢復(fù)投餌，幼體依然不能再次恢復(fù)正常發(fā)育[24]。本研究中，中華絨螯蟹幼體及仔蟹肝胰腺細(xì)胞種類的變化規(guī)律也表明了中華絨螯蟹在幼體和仔蟹階段發(fā)育迅速，需要的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均由消化吸收功能支撐，而其儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力尚不健全。因此，在中華絨螯蟹苗種培育階段，采用適口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值全面的餌料和合理的投喂節(jié)律是促進(jìn)其正常生長(zhǎng)發(fā)育和提高苗種存活率的重要保障。