高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留

馬麗莎，謝文平，尹 怡，單 奇，劉書貴，李麗春，趙 成，戴曉欣，魏林婷，鄭光明

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(廣州)，農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點實驗室，廣東 廣州 510380)

2017年，歐盟爆出的“毒雞蛋”事件將氟蟲腈及其代謝物推上了食品安全的風口浪尖。氟蟲腈是苯基吡唑類新型高活性殺蟲劑，可阻礙昆蟲γ-氨基丁酸控制氯化物代謝[1]，被廣泛用于水稻等多種經(jīng)濟作物的蟲害防治[2]。但是，氟蟲腈具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、可致癌性等[3-7]，在環(huán)境中能夠代謝為比自身毒性更強的氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈等產(chǎn)物[8]，故被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中等毒性”的化學品[9]。目前，氟蟲腈已被歐盟禁止用于人類食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過程，我國也限制了其銷售和使用[10]。因氟蟲腈對害蟲具有較好的生物活性，在20世紀90年代后期，其曾在我國大范圍推廣使用[11]。相關研究表明[12-13]，僅2%～20%氟蟲腈被農(nóng)作物吸收，其余滯留在土壤中極難降解。我國青島膠州灣水域和沉積物[14]、北京和山東玉米種植地[15]、浙江沿海海產(chǎn)品[16]中均檢出氟蟲腈及其代謝物殘留。可見，我國自然環(huán)境中存在氟蟲腈污染的潛在風險。

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，稻漁綜合混養(yǎng)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)轉型升級的新模式，屬環(huán)境依賴型產(chǎn)業(yè)[17]。環(huán)境中殘留的氟蟲腈可在稻漁水產(chǎn)品中富集并通過食物鏈危害人體健康，從而影響我國稻田漁的綠色發(fā)展。目前，關于環(huán)境中氟蟲腈及其代謝物檢測的報道多集中于自然水體、沉積物及農(nóng)田土壤[14-15,18]，尚未見稻漁土壤的報道。因此，為保障我國稻漁水產(chǎn)品的質量安全，開展稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留的安全風險監(jiān)測尤為必要。

氟蟲腈及其代謝物檢測常用的方法主要有氣相色譜(GC)法[19-20]，氣相色譜-質譜 (GC-MS)) 法[21-22]，以及高效液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS) 法[23-27]等。樣品前處理方法有索氏提取法、超聲萃取法、加速溶劑萃取法等。由于稻漁土壤成分復雜、目標物含量低、基質干擾嚴重，因此，省時、高效、萃取充分的加速溶劑萃取法(ASE)被美國環(huán)境保護署(EPA)收錄為處理固體樣品的標準方法之一。但ASE極強的萃取能力，使萃取液中的雜質含量較多，易造成固相萃取小柱堵塞，不利于樣品的后續(xù)凈化，故在環(huán)境樣品預處理中，通常需要使用加速溶劑萃取-凝膠滲透凈化，然而加速溶劑萃取儀和凝膠滲透色譜儀的價格昂貴、維護成本高，因此，該方法不利于在基層和檢測一線的普及應用。

本研究擬采用恒溫振蕩-固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測土壤中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物，利用恒溫振蕩儀輔助萃取、固相萃取柱凈化，希望實現(xiàn)稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留的批量化檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470三重四極桿液相色譜-質譜聯(lián)用儀、ZORBAX Extend-C18色譜柱：美國Agilent公司產(chǎn)品；IKA MS3 basic渦旋振蕩儀：德國IKA公司產(chǎn)品；TDL-5-A飛鴿牌離心機：中國上海安亭公司產(chǎn)品；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司產(chǎn)品；HZ-9311K落地恒溫搖床：中國金壇市盛藍儀器制造有限公司產(chǎn)品；Supelclean ENVI-18固相萃取柱(500 mg/3 mL)：美國Supelco公司產(chǎn)品；石墨化炭黑(GCB 120～400目)：德國CNW公司產(chǎn)品。

氟蟲腈(fipronil)、氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氟蟲腈亞砜(fipronil sulfide)和氟蟲腈砜(fipronil sulfone)標準物質：純度均大于99%，德國Dr. Ehrenstorfor公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸：均為色譜純，美國霍尼韋爾公司產(chǎn)品。

1.2 溶液的配制

1.2.1標準儲備液的配制 分別稱取適量的標準物質，用乙腈溶解，配制成1.0 g/L 的標準儲備液，于-18 ℃避光保存。

1.2.2混合標準溶液的配制 分別移取適量的標準儲備液，用乙腈配制成10 mg/L的混合標準溶液，于-18 ℃避光保存。

1.2.3基質標準工作溶液的配制 量取一定體積的混合標準溶液，用陰性樣品提取凈化后，將溶液稀釋至適用濃度，配制成基質標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 前處理方法

1.3.1樣品制備 采集具有代表性的稻花鯉養(yǎng)殖泥塘的塘泥，經(jīng)冷凍干燥、研磨后，過20目篩，然后將其裝入密封袋中，于4 ℃保存，備用。

1.3.2提取 準確稱取(4±0.02) g土壤樣品于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，旋渦混合1 min，然后將塑料離心管放入35 ℃恒溫振蕩器中，以150 r/min振蕩4 h，以5 000 r/min離心5 min，取上清液，定容至20 mL比色管，備用。

1.3.3凈化 在ENVI-18固相萃取柱上端裝入10 mg GCB粉末，用6 mL乙腈活化并棄去流出液，加入5 mL提取液，控制流速不超過1滴/秒，并用3 mL乙腈洗脫，收集全部流出液于10 mL玻璃離心管中，于35 ℃水浴中氮吹至干。準確加入1 mL乙腈溶解殘渣，渦旋震蕩1 min，將溶液移入2 mL離心管中，以10 000 r/min離心5 min，用0.22 μm濾膜過濾，待HPLC-MS/MS檢測。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 ZORBAX Extend-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱溫35 ℃；流動相：A為0.05%氨水，B為乙腈；梯度洗脫條件：0～1 min(30%B)，1～15 min(30%～60%B)，15～17 min(60%～30%B)；進樣量5 μL；流速0.4 mL/min。

1.4.2質譜條件 電噴霧電離源負離子模式(ESI-)，多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式，離子源溫度325 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力3.10×105Pa，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流量12 L/min，毛細管電壓3 500 V。氟蟲腈及其代謝物的質譜參數(shù)列于表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of fipronil and its metabolites

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1提取方法的優(yōu)化 冷凍干燥使土壤樣品緊縮，導致阻力增大，萃取溶劑穿透力降低，有機溶劑很難滲透入土壤基質中萃取殘留物。本實驗采用恒溫振蕩法提取土壤中的氟蟲腈及其代謝物，在長時間加熱及振蕩的條件下使目標物逐漸從土壤微粒表面解離至提取劑中，繼而提高目標物的萃取效率。為選擇適宜的萃取時間，本實驗比較了不同振蕩時間下4種目標物的回收率，結果示于圖1。可見，4種目標物的回收率隨著萃取時間的增加而升高，4 h時回收率均在90%左右。因此，選擇4 h為最佳萃取時間。與加速溶劑萃取儀及超聲波提取儀相比，恒溫振蕩儀價格低廉、操作簡單，可實現(xiàn)樣品的批量化處理，利于實驗室間的普及。

圖1 不同提取時間對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction time on the recoveries of fipronil and its metabolites

2.1.2提取試劑的選擇 乙腈是食品中藥物殘留分析常用的提取劑，其穿透力強、提取效率高，對土壤中色素、蠟質、脂肪等非極性成分的提取能力弱，有利于樣品的后續(xù)凈化。參考文獻[28]的方法，由于氟蟲腈及其代謝物為酸性化合物，在乙腈中引入甲酸可抑制目標物的解離，提高溶解度，本實驗比較了乙腈、0.1%甲酸-乙腈兩種提取溶劑對4種目標物的提取效率。結果表明，乙腈及0.1%甲酸-乙腈對土壤中氟蟲腈及其代謝物的提取回收率均在70%～120%之間，但酸化乙腈的基質效應大于50%，相對標準偏差較大，表現(xiàn)為提取液的顏色較深。這可能與稻漁塘泥富含腐殖質、腐殖酸等酸性物質有關，酸化乙腈易將塘泥中腐殖酸等干擾物質萃取出來，導致其色素干擾明顯，因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.3凈化方法的優(yōu)化 PestiCarb/NH2固相萃取柱由石墨化炭黑和氨基裝填而成，可吸附色素、脂肪酸、有機酸等雜質，常被用于土壤提取液的凈化。實驗發(fā)現(xiàn)，采用PestiCarb/NH2凈化稻漁土壤提取液后，其總離子流色譜圖上有較大的雜質峰，回收率在56%～137%之間，凈化不徹底。這可能與稻漁土壤基質成分復雜有關，受漁業(yè)活動的影響，土壤中不僅富含色素、有機酸、腐殖酸等干擾物，還含有蛋白、脂類等雜質。ENVI-18是硅膠鍵合三官能十八烷基柱，碳含量高達17%，對脂類等非極性雜質具有較強的吸附能力。本實驗選擇ENVI-18柱凈化稻漁土壤提取液，除氟甲腈的回收率大于120%外，其他化合物的回收率均在70%～120%之間，可能由于對色素雜質凈化不完全，凈化液呈淡黃色，故在ENVI-18柱上端裝入GCB粉末去除色素。結果表明，凈化液清澈透明，基線平穩(wěn)，在去除了雜質峰的同時，還得到了滿意的目標物回收率84.5%～103.3%，相對標準偏差小于15%，示于圖2。若GCB粉末用量過多，則可吸附目標物，實驗最終選擇ENVI-18柱和10 mg GCB粉末凈化稻漁土壤提取液。

注：a.ENVI-18；b.PestiCarb/NH2；c.ENVI-18+10 mg GCB圖2 不同萃取柱對提取液的凈化效果Fig.2 Purification effect of different extraction columns on extraction solutions

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物為酸性物質，因此在負離子模式下檢測，向流動相中加入氨水可促進化合物電離以增強質譜響應，提高儀器靈敏度，因此選擇耐堿性的色譜柱進行分離。Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)采用雙齒鍵合和雙封端技術，提供了高pH值(范圍在2～11.5之間)穩(wěn)定性，適用于高pH值下化合物的分離。本實驗比較了在乙腈-水、0.02%氨水-乙腈、0.05%氨水-乙腈、0.1%氨水-乙腈、0.2%氨水-乙腈為流動相時，目標物的分離度及響應值。結果顯示：目標物在乙腈-水溶液中的響應值低于氨水-乙腈溶液，同時其響應值隨著氨水濃度的升高而升高，但流動相中氨水濃度過高會縮短儀器管路、轉子密封圈等部件的使用壽命。0.1%氨水體系的pH值已高達10.8，因此，在滿足分析要求的前提下，選擇0.05%氨水-乙腈溶液作為流動相。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物的化學結構中均含有NH2基團，在負離子模式下易失去H形成準分子離子。因此，采用流動注射單標準儲備液的形式，在m/z100～2 000范圍內以ESI-掃描方式獲取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜的母離子，并在碰撞能10～50 eV范圍內選擇響應最高的2種產(chǎn)物離子作為子離子，豐度最強的二級碎片離子作為定量離子，豐度次強的碎片離子作為定性離子，并在此基礎上進一步優(yōu)化錐孔電壓、毛細管電壓及二級錐孔碰撞電壓等參數(shù)，使各離子對的響應及信噪比達到最佳值，優(yōu)化結果列于表1。錐孔電壓主要影響離子進入質譜儀的速度，錐孔電壓高，則離子速度快、損失小、靈敏度高，但過高的錐孔電壓會增加離子間的碰撞，引起源內裂解，影響檢測靈敏度。毛細管電壓提供液滴過量電荷，使目標化合物離子化。二級錐孔碰撞電壓使進入到一級錐孔的離子發(fā)生偏轉，可以去除大部分基質，減少干擾。毛細管電壓及二級錐孔碰撞電壓過低均可導致化合物離子化效率低，過高則會引起離子源內碎裂。

2.4 基質效應

為克服基質效應(ME)，常用的方法有基質匹配曲線法、穩(wěn)定同位素內標法等，由于穩(wěn)定同位素內標價格較昂貴，且并非所有化合物都能找到合適的內標，因此廉價、操作簡便的基質匹配曲線法被廣泛應用于液相色譜-質譜法的定性及定量分析。ME=(基質匹配標準溶液峰面積/試劑標準溶液峰面積-1)×100%。當ME<±10%，基質效應可忽略，用溶劑標準曲線定量即可；當±10%±50%，基質效應對定量的干擾較大，應優(yōu)化樣品預處理方法使ME<±50%。本實驗采用基質匹配曲線法對氟蟲腈及其代謝物在稻漁土壤中的基質效應進行評價，結果列于表2。可見，稻漁土壤的ME在6.1%～27.7%之間，說明稻漁土壤前處理方法可滿足分析需要。

2.5 方法學考察

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限 在優(yōu)化的條件下，配制氟蟲腈及其代謝物的基質混合標準溶液。經(jīng)HPLC-MS/MS測定后，以農(nóng)藥基質標準溶液質量濃度為橫坐標，農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線；分別以添加回收樣品峰響應值3倍和10倍噪音的添加濃度為方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，其結果列于表2。氟蟲腈及其代謝物在0.5～100 μg/L濃度范圍內的線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.998，檢出限和定量限分別為1.0、3.0 μg/kg。

2.5.2回收率與精密度 以空白稻漁土壤為基質進行加標回收實驗，添加濃度分別為2.5、5.0、12.5 μg/kg，每個添加濃度設6個平行實驗，并做空白實驗，基質匹配標準曲線法進行定量分析，結果列于表3。4種化合物的平均加標回收率在83.5%～110.3%之間，相對標準偏差在1.9%～11.5%之間，均小于15%，表明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性，可滿足稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留的分析需求。

3 實際樣品檢測

將本方法用于30份稻漁土壤樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測。結果表明：1份樣品中檢出氟蟲腈殘留，含量為1.52 μg/kg，4份樣品中檢出氟蟲腈砜殘留，含量分別為1.05、1.27、1.38、1.58 μg/kg，其余組分無檢出。發(fā)現(xiàn)氟蟲腈砜是氟蟲腈的主要降解產(chǎn)物，這與文獻[29]的結論一致。

表2 氟蟲腈及其代謝物在土壤基質中的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) of fipronil and its metabolites

表3 稻漁土壤中4種農(nóng)藥的回收率和精密度(n=6)Table 3 Average recovery and precision of 4 kinds of pesticides in rice fishing soil (n=6)

4 結論

本工作建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物殘留。采用恒溫振蕩法萃取、固相萃取柱凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測，檢出限和定量限分別為1.0、3.0 μg/kg，平均回收率在83.5%～110.3%之間，相對標準偏差在1.9%～11.55%之間，能夠滿足《NY/T 788—2018 農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》要求[30]。該方法操作簡單、經(jīng)濟、準確可靠、重現(xiàn)性好，有利于在基層和檢測一線的普及應用，可為稻漁土壤中氟蟲腈及其代謝物的殘留監(jiān)控提供技術手段。