高效液相色譜法檢測化妝品中4-甲基芐亞基樟腦的不確定度評定

邢海艷，孫麗，劉洋，蘇晶

(淮安市食品藥品檢驗所，江蘇淮安 223005)

隨著生活水平的提高，人們對外在越來越注重，化妝品行業(yè)得到了飛速的發(fā)展?；瘖y品從功能上分為清潔類化妝品、護理類化妝品、美容修飾類化妝品等三大類［1］。根據(jù)《化妝品監(jiān)督管理條例》及實施細則，將化妝品分為特殊化妝品和非特殊化妝品，其中特殊化妝品包括育發(fā)、染發(fā)、燙發(fā)、脫毛、美乳、健美、除臭、祛斑美白和防曬等九類化妝品［2-3］。防曬劑是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保護皮膚免受特定紫外線所帶來的傷害或保護產(chǎn)品本身而在化妝品中加的物質(zhì)［3-4］。防曬劑對皮膚有保護作用，但過量使用也會影響皮膚健康，如過敏、泛紅、光敏、發(fā)炎等［5］。

測量不確定度又稱不確定度，指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度，表征合理的賦予被測量之值的分散性［6-7］。不確定度的考察是對實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量管理重要的一個參數(shù)，特別是對邊緣樣品、不合格樣品的不確定度評估?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）規(guī)定了化妝品中可使用27種防曬劑，提供了21種物質(zhì)的檢測方法［4］。近幾年，不確定度在化妝品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多［8-11］，筆者按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中5.1的方法，對能力驗證樣品中4-甲基芐亞基樟腦的含量測定進行不確定度考察。4-甲基芐亞基樟腦是準用紫外吸收劑，被廣泛添加在化妝品中［4，13］，允許添加的限度為4%；通過比較分析4-甲基芐亞基樟腦含量測定不確定度的來源，建立4-甲基芐亞基樟腦不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，抓住影響不確定度的關(guān)鍵因素，從而進一步提高實驗室質(zhì)量管理水平。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695／2998型，美國Waters公司。

超聲清洗儀：KQ-250DV型，昆山市超聲儀器有限公司。

Millipore超純水機：美國Millipore公司。

0.22 μm有機系針筒式微孔濾膜：上海安譜公司。

乙腈、四氫呋喃：色譜純，德國默克公司。

高氯酸：優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑股份有限公司。

4-甲基芐亞基樟腦標準品：質(zhì)量分數(shù)為99.0%，德國DR EHRENSTORFER公司。

混合溶劑：甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸按體積比250∶450∶300∶0.2配制。

1.2 高效液相色譜條件

色 譜 柱：CAPCELL PAK MG Ⅱ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司）；流動相：A相為甲醇，B相為四氫呋喃，C相為水-高氯酸（體積比為300∶0.2），按表1進行梯度洗脫；流量：1.0 mL／min ；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3 樣品前處理

稱取樣品0.25 g，置于25 mL具塞試管中，加入混合溶劑20 mL，超聲30 min，放冷，稀釋至標線，過濾，取續(xù)濾液1 mL，用混合溶劑稀釋至10 mL，混勻后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為待測溶液。

1.4 標準曲線的配制

取4-甲基芐亞基樟腦標準品10.32 mg，置于100 mL量瓶中，加混合溶劑溶解并稀釋至標線，配制成4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度為0.102 2 mg／mL的標準儲備溶液。再分別取上述標準儲備溶液1、2、5、10、20、50 mL，用混合溶劑稀釋至 100 mL，配制成4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度分別為1.022、2.044、5.110、10.22、20.44、51.10 μg／mL 的系列標準工作溶液，以4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度為橫坐標、對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

1.5 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量分數(shù)按式(1)計算。

式中：w——樣品中4-甲基芐亞基樟腦的的質(zhì)量分數(shù)，%；

ρ——樣品中被測組分的質(zhì)量濃度，μg／mL；

V——樣品溶液定容體積，mL；

m——樣品稱樣量，g；

f——稀釋倍數(shù)，f=10。

2 不確定的來源

從檢測過程和數(shù)學(xué)模型分析［14］，4-甲基芐亞基樟腦含量測定的不確定度來源主要有以下幾方面。

（1）樣品溶液測定引入的標準不確定度：包括4-甲基芐亞基樟腦標準品的純度引入的標準不確定度，4-甲基芐亞基樟腦標準品的稱量引入的標準不確定度，標準品系列溶液的配制引入的標準不確定度，標準曲線的擬合引入的標準不確定度。

（2）樣品處理引入的標準不確定度：包括樣品稱量引入的標準不確定度，樣品溶液制備引入的標準不確定度，樣品測定重復(fù)性引入的標準不確定度，樣品的提取回收率引入的標準不確定度。

（3）高效液相色譜儀引入的標準不確定度。

3 不確定度評定

3.1 樣品溶液測定引入的標準不確定度

3.1.1 標準品純度引入的相對標準不確定度urel(P)

證書上標注4-甲基芐亞基樟腦標準品的純度為99.0%，不確定度為1.25%，取包含因子則由標準品純度引入的相對標準不確定度：

3.1.2 標準品稱量引入相對標準不確定度urel(mR)

4-甲基芐亞基樟腦的取樣量mR=10.32 mg，其稱量不確定度來源有3項：（1）重復(fù)性；（2）分辨率；（3）示值誤差。評定結(jié)果如表2所示。

表2 標準品稱量時各分量不確定度

由于稱量是兩次，則4-甲基芐亞基樟腦標準品稱量引入的相對標準不確定度：

3.1.3 標準工作溶液配制引入的相對標準不確定度urel(C)

依 據(jù) GB／T 12806—2011、JJG 196—2006等標準的要求［15-18］，評定標準品系列溶液配制時所用的移液管、容量瓶引入的不確定度包括：（1）移液管、容量瓶校準引入的標準不確定度，按三角分布考慮，；（2）溫度導(dǎo)致溶液膨脹引入的標準不確定度。水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4／℃，實驗室溫度波動在±5℃范圍內(nèi)，按矩形分布考慮，。各分量的標準不確定度評定見表3。

表3 各玻璃器皿使用的不確定度

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，合成得標準品溶液配制引入的相對標準不確定度：

3.1.4 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(curve)

按照1.4配制系列標準工作溶液，每個標準溶液測定2次，以4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度(ρ)對應(yīng)的峰面積(A)繪制標準曲線，計算得線性方程為A=46 711ρ-1 003.6，相關(guān)系數(shù)為0.999 95。對同一樣品溶液測定6次，得樣品中4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度平均值為ρ=8.187 3 μg／mL。按式(2)、(3)計算標準曲線擬合引入的標準不確定度u(curve)：

式中：s(A)——各標準溶液峰面積的標準偏差；

n——標準溶液測定次數(shù)，n=2；

m——標準溶液個數(shù)，m=6；

Ai——第i個標準溶液的峰面積測定值；

a——標準曲線的斜率；

ρi——第i個標準溶液的質(zhì)量濃度，μg／mL；

b——標準曲線的截距；

p——樣品平行測定次數(shù)，p=6；

ρ——樣品溶液中4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量濃度，μg／mL；

——標準曲線系列溶液的平均質(zhì)量濃度，μg／mL。

計算得標準曲線擬合引入的相對標準不確定：urel(curve)=u(curve)／ρ=0.064 32／8.187 3=0.007 86

以上各不確定度分量互不相關(guān)，合成得樣品溶液測定引入的標準不確定度：

3.2 樣品處理引入的標準不確定度

3.2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(ms)

樣品的平均稱樣量為ms=0.254 4 g，其不確定度來源有 3 項：（1）重復(fù)性；（2）分辨率；（3）示值誤差。樣品稱量時各分量的不確定度評定結(jié)果見表4。

表4 樣品稱量時各分量的不確定度

按照表4合成得相對標準不確定度：

3.2.2 樣品溶液配制引入的相對標準不確定度urel(Vs)

稱樣后，加混合溶劑提取稀釋定容至25 mL，再精密量取1 mL，稀釋至10 mL。其不確度來源有：（1）移液管、具塞試管、容量瓶校準引入的不確定度；（2）溫度導(dǎo)致溶液膨脹引入的的不確定度，結(jié)果見表5（計算方法同表3）。

表5 樣品溶液配制時各玻璃器皿引入的不確定度

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，合成得相對標準不確定度：

3.2.3 樣品測定重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel(s)

對樣品中4-甲基芐亞基樟腦的含量測定了6次，結(jié)果分別為 0.790%、0.818%、0.817%、0.810%，0.804%、0.797%，計算得6次測定結(jié)果的標準偏差s=0.0111%，平均含量w=0.804%，則樣品測定重復(fù)性引入的相對標準不確定度：

3.2.4 樣品提取回收率引入的相對標準不確定度urel(R)

取空白樣品6份，進行了加標回收率實驗，各測定 2 次 (n=6，N=2)，結(jié)果見表 6。

表6 樣品提取的回收率數(shù)據(jù)

則樣品提取回收率引入的相對標準不確定度：

以上各不確定度分量urel(ms)、urel(Vs)、urel(s)、urel(R)互不相關(guān)，合成得樣品處理引入的相對標準不確定度：

3.3 儀器引入的相對標準不確定度

儀器引入的相對標準不確定度用連續(xù)測量標準品溶液的重復(fù)性表示，取濃度為5.108 5 μg／mL的4-甲基芐亞基樟腦標準溶液連續(xù)測定5次(n=5)，峰面積測定結(jié)果分別為237 543、240 154、240 199、245 454、237 783，計算得峰面積平均值A(chǔ)=240 227，標準偏差s(L)=3 182，則儀器引入的相對標準不確定度：

4 合成不確定度

以上各相對標準不確定度分量urel(ρ)、urel(S)、urel(L)互不相關(guān)，合成得4-甲基芐亞基樟腦含量測定結(jié)果的相對標準不確定：

實驗中測得樣品中4-甲基芐亞基樟腦的含量w=0.804%，則4-甲基芐亞基樟腦含量測定結(jié)果的標準不確定度：

根據(jù)JJF 1135—2005 《化學(xué)分析測量不確定度評定》和JJF 1059.1—2012 《測量不確定度評定與標示》［7，19］，取包含因子k=2，置信區(qū)間為 95% 時，擴展不確定為U=ku(w)=2×0.014 8%=0.030%，當(dāng)樣品中4-甲基芐亞基樟腦的質(zhì)量分數(shù)為0.804%時，結(jié)果表示為(0.804±0.030)%，k=2。

5 結(jié)論

以能力驗證樣品為研究對象，按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版5.1的檢測方法對4-甲基芐亞基樟腦的含量測定進行不確定度分析。根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型，對不確定度的各分量進行評定。結(jié)果表明，4-甲基芐亞基樟腦含量測定的不確定度最主要的來源是標準曲線的擬合、樣品的提取回收率和標準品純度引入的不確定度，其次是標準品稱量、儀器測量重復(fù)性、樣品測量重復(fù)性引入的不確定度，最后是樣品溶液的配制、標準品溶液的配制和樣品的稱量引入的不確定度。因此，在實驗室質(zhì)量管理過程中，應(yīng)注意標準曲線系列溶液的濃度與樣品溶液的濃度接近，標準品稱量時可選擇精度更高的天子天平，對儀器設(shè)備定期進行期間核查，實驗人員可適量增加平行試驗的次數(shù)來降低不確定度，標準品采購時要考察各個品牌的純度與不確定度，從而提高實驗的準確度，減少不確定度，最終優(yōu)化和完善實驗室質(zhì)量管理。