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    泛素水解酶22對(duì)舌鱗癌細(xì)胞侵襲與遷移的影響

    2021-12-02 07:20:50劉起馮元勇葛勝優(yōu)尚偉
    精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:泛素鱗癌質(zhì)粒

    劉起 馮元勇 葛勝優(yōu) 尚偉

    (1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科,山東 青島 266003; 2 高密市人民醫(yī)院口腔科)

    口腔鱗癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中舌鱗癌是最常見(jiàn)的口腔腫瘤[1-2]。治療方式主要有手術(shù)以及放化療,患者5年的生存率約為50%[3-4]。泛素水解酶-22(USP-22)是泛素特異性加工酶家族的成員,主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及激活基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程,與食管癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5-8]。但是USP-22基因與舌鱗癌生物學(xué)行為的相關(guān)性報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)臨床舌鱗癌患者腫瘤組織中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),并探討siRNA-USP-22沉默質(zhì)粒對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響,以期為臨床上舌鱗癌的治療提供新的靶點(diǎn)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料和方法

    1.1

    人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113 細(xì)胞及 Tb 細(xì)胞均購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清(以色列BI公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司);Real-time PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);CCK-8試劑盒以及Transwell試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。

    1.2

    選取2014年2月—2019年7月青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除的21例舌鱗癌患者(男11例,女10例)的腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本,將標(biāo)本置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的甲醛溶液中,Bouin氏固定液固定,乙醇脫水后制備成蠟塊,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3

    將收集到的舌鱗癌組織和癌旁組織標(biāo)本,根據(jù)病理檢測(cè)結(jié)果分為癌旁組織(對(duì)照組)21例,舌鱗癌高分化組(高分化組)11例及舌鱗癌中低分化組(中低分化組)10例。對(duì)所有標(biāo)本按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色處理,于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

    1.4

    先將人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113 細(xì)胞以及Tb細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合率達(dá)60%以上時(shí)棄掉含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基,給予去極化處理,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.5

    利用PubMed基因庫(kù)篩選USP-22基因序列,設(shè)計(jì)USP-22基因擴(kuò)增序列,以環(huán)狀RNA為載體,構(gòu)建沉默該基因的siRNA質(zhì)粒,慢病毒包裝后進(jìn)行后續(xù)舌鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。根據(jù)是否轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,將細(xì)胞分為T(mén)CA8113細(xì)胞對(duì)照組(A組)、TCA8113細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組(B組)、TCA8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染組(C組)及Tb細(xì)胞對(duì)照組(D組)、Tb細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組(E組)、Tb細(xì)胞轉(zhuǎn)染組(F組)。C組和F組細(xì)胞給予慢病毒包裝的siRNA質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,感染復(fù)數(shù)為50,慢病毒滴度為3×1010U/L,B組和D組細(xì)胞給予慢病毒包裝的空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,A組和C組細(xì)胞給予等量PBS溶液作為對(duì)照。

    1.6

    將經(jīng)慢病毒包裝的質(zhì)粒處理72 h后的A~F組細(xì)胞離心,接種于6孔板中,使用無(wú)菌10 μL槍頭畫(huà)一寬0.5 mm的劃痕,加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基,分別于0 和12 h在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

    1.7

    將A~F組細(xì)胞按照Transwell試劑盒的說(shuō)明書(shū)要求,配置基質(zhì)膠,與預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基混合,加入結(jié)晶紫染色試劑孵育,在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組侵襲細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

    1.8

    2 結(jié) 果

    2.1

    染色結(jié)果顯示,對(duì)照組組織內(nèi)未見(jiàn)癌巢及角化珠(圖1A);高分化組癌巢與周?chē)M織界限清楚,可見(jiàn)癌巢和角化珠(圖1B);中低分化組癌巢與周?chē)M織無(wú)明顯界限,無(wú)明顯角化珠(圖1C)。

    A:對(duì)照組,B:高分化組,C:中低分化組,200倍

    2.2

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,對(duì)照組、高分化組以及中低分化組中USP-22蛋白的表達(dá)量分別為1.014±0.001、1.110±0.023、1.131±0.010,ERK5蛋白的表達(dá)量分別為1.143±0.007、1.201±0.014、1.208±0.009,3組間兩種蛋白的表達(dá)量比較差異均具有顯著性(F=377.72、211.29,P<0.05),其中高分化組和中低分化組中USP-22蛋白和ERK5蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均具有顯著意義(q=22.72~34.13,P<0.05),高分化組中USP-22蛋白的表達(dá)量與中低分化組比較,差異具有顯著性(q=5.39,P<0.05)。

    2.3

    A、B和C組細(xì)胞的遷移距離分別為(92.47±2.02)、(98.46±10.48)和(63.34±12.10)μm,3組細(xì)胞遷移距離比較差異具有顯著意義(F=12.21,P<0.05),其中C組細(xì)胞的遷移距離明顯短于A、B組(q=5.41、6.53,P<0.05)。D、E和F組細(xì)胞的遷移距離分別為(92.72±2.93)、(93.48±3.95)和(73.15±6.45)μm,3組細(xì)胞遷移距離比較差異具有顯著性(F=18.17,P<0.05),其中F組細(xì)胞遷移距離明顯短于D、E組(q=7.24、7.52,P<0.05)。

    2.4

    A、B和C組侵襲細(xì)胞的數(shù)量分別為(61.33±3.81)、(59.31±3.07)和(36.03±4.15)個(gè),3組細(xì)胞侵襲能力比較差異具有顯著意義(F=43.22,P<0.05),其中C組細(xì)胞的侵襲能力明顯低于A、B組(q=11.83、10.89,P<0.05)。D、E和F組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為(99.18±2.18)、(98.32±2.61)和(69.87±10.69)個(gè),3組細(xì)胞侵襲能力比較差異具有顯著性(F=19.90,P<0.05),其中F組細(xì)胞侵襲能力明顯低于D、E組(q=7.84、7.61,P<0.05)。

    3 討 論

    舌鱗癌是臨床上常見(jiàn)的口腔腫瘤,目前針對(duì)舌鱗癌僅局限于手術(shù)切除腫瘤并結(jié)合放化療進(jìn)行綜合治療,對(duì)于晚期的舌鱗癌患者,手術(shù)效果欠佳,5年生存率較低[9]。因此,需要尋找更為準(zhǔn)確的分子標(biāo)志物,從而做到早期診斷和早期治療,這對(duì)提高患者的預(yù)后非常重要。

    USP-22是泛素蛋白特異性蛋白酶家族中的一員,屬于去泛素酶家族。泛素特異性蛋白酶是去泛素酶家族中最大且最具特異性的亞家族,具有物種和組織特異性,其核心催化域約由350個(gè)氨基酸組成。既往研究認(rèn)為,USP-22與人宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化功能密切相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn),USP-22基因可以通過(guò)Sirt1/JAK/STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力[11-12]。USP-22基因還可以介導(dǎo)胰腺癌的自噬過(guò)程,USP-22基因敲除實(shí)驗(yàn)顯示,其可以通過(guò)促進(jìn)自噬抑制吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞凋亡[13-14]。ERK5信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路中的一員,可以參與細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程[15-17]。既往研究表明,ERK5蛋白的差異性表達(dá)與前列腺癌的增殖以及侵襲密切相關(guān),并且ERK5的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[18-19]。也有研究發(fā)現(xiàn),ERK5也與非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20-21]。同時(shí)ERK5蛋白在食管鱗癌組織中具有差異性表達(dá)的特點(diǎn),可以作為分子標(biāo)志物。但是,USP-22和ERK5在舌鱗癌發(fā)生中的作用鮮有報(bào)道。因此,本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)舌鱗癌患者的癌旁組織、高分化以及中低分化舌鱗癌組織中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,高分化組和中低分化組中USP-22和ERK5蛋白的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組,相較于癌旁組織,高分化和中低分化舌鱗癌組織中可以檢測(cè)到USP-22和ERK5的高表達(dá),提示USP-22和ERK5可以作為舌鱗癌的生物標(biāo)志物,對(duì)其早期診斷和早期治療起到一定的提示作用。

    為進(jìn)一步揭示舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移機(jī)制,本研究選取了兩種舌鱗癌細(xì)胞系,即人舌鱗癌細(xì)胞系TCA8113細(xì)胞及Tb細(xì)胞作為研究對(duì)象,應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA沉默質(zhì)粒對(duì)上述兩種細(xì)胞的侵襲與遷移能力的影響。結(jié)果證明,siRNA沉默質(zhì)粒沉默USP-22基因表達(dá)后,可以有效抑制舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

    綜上所述,USP-22與ERK5可以作為舌鱗癌早期診斷的生物標(biāo)志物,siRNA-USP-22沉默USP-22基因表達(dá)后可以有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。但本研究中臨床樣本例數(shù)較少,而且侵襲與遷移能力的測(cè)試均是進(jìn)行的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),后續(xù)應(yīng)該加大樣本量以及進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗(yàn),為臨床提供更加真實(shí)可靠的參考數(shù)據(jù)。

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