膽道閉鎖的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展

詹 鏞 綜述 鄭 珊 審校

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是兒童最常見的膽汁淤積性疾病，以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為主要特征，臨床上多表現(xiàn)為出生后數(shù)周內(nèi)的持續(xù)性黃疸以及進(jìn)行性膽汁淤積，是導(dǎo)致兒童肝移植最常見的原因[1,2]。中國臺灣的BA發(fā)病率為1/5 000，歐洲地區(qū)為1/18 000，美國為1/12 000[3]，中國大陸尚無BA發(fā)病率的準(zhǔn)確統(tǒng)計數(shù)據(jù)。目前BA的標(biāo)準(zhǔn)治療方法為盡早行Kasai手術(shù)(肝門空腸吻合術(shù))，但手術(shù)治療后僅有部分患者能夠達(dá)到自體肝存活，其余仍需接受肝移植才能長期存活。因此，對BA發(fā)病機制以及治療的探索尤為重要。

表觀遺傳學(xué)是研究在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因的激活和失活或基因表達(dá)水平變化引起遺傳改變的遺傳學(xué)分支學(xué)科。近年來對BA的遺傳學(xué)研究層出不窮，而其中表觀遺傳學(xué)研究逐漸增多，極大豐富并完善了BA的發(fā)生機制學(xué)說。由于這些表觀遺傳學(xué)上的改變在BA中頻繁發(fā)生，因此被認(rèn)為是早期發(fā)現(xiàn)BA、預(yù)測其預(yù)后和治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。此外，這些表觀遺傳學(xué)上的改變是潛在可逆的，因此也可能作為潛在的治療靶點。本文就表觀遺傳學(xué)中的小分子核糖核酸、DNA甲基化等在BA中的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、小分子核糖核酸(miRNA)

miRNA是一個龐大的小分子調(diào)控RNA家族，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。編碼miRNA的基因通過RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ轉(zhuǎn)錄出初級產(chǎn)物pri-miR。pri-miR經(jīng)過切割修飾形成發(fā)夾型結(jié)構(gòu)的pre-miR，并且在細(xì)胞質(zhì)中被加工為成熟的雙鏈miRNA。最終miRNA雙鏈體中的一條鏈被降解，而另一條鏈通過兩種途徑發(fā)揮作用：一是參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)，二是通過與AGO蛋白或高密度脂蛋白/低密度脂蛋白結(jié)合后被釋放到細(xì)胞外[4]。

(一)miRNA參與BA發(fā)病的可能機制

BA的發(fā)病機制尚未明確，目前較被接受的觀點是多種病理過程相互作用，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，如感染、母體接觸毒物等因素引起免疫炎癥及膽管上皮損傷等病理過程，并且膽管上皮損傷引起更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)會繼續(xù)加重膽管損傷，最終導(dǎo)致BA的發(fā)生[1]。近年來，許多研究提示miRNA在膽道閉鎖發(fā)病過程中可能發(fā)揮著重要作用，給未來BA的治療方案帶來了新的思路。

1. miRNA與膽管上皮細(xì)胞 miRNA可能通過調(diào)控膽管上皮的狀態(tài)及功能參與BA的發(fā)生。在BA小鼠模型中，Hand等[5]研究發(fā)現(xiàn)miR-29表達(dá)水平升高，且miR-29能夠通過下調(diào)胰島素樣生長因子受體，增加膽管上皮細(xì)胞死亡的可能性。而另一項研究也提出，行膽道結(jié)扎后小鼠肝臟組織中的miR-124表達(dá)明顯下降，并伴有miR-200表達(dá)增加，而這一現(xiàn)象也在BA患者肝組織中得到了驗證[6]。這兩種miR的表達(dá)變化，能夠通過白介素-6/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子3(interleukin-6/signal transducer activator of transcription 3,IL-6/STAT3)通路促進(jìn)膽道細(xì)胞的增殖。這些研究均表明，miRNA可能對膽管上皮細(xì)胞的功能及狀態(tài)具有重要的調(diào)控作用。此外，Bessho等[7]還檢測了小鼠模型中肝外膽管與膽囊的miRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-30b/c、-133a/b、-195、-200a、-320和-365等8種miRNA相關(guān)靶基因的表達(dá)量顯著增加，與免疫應(yīng)答及器官發(fā)育過程具有關(guān)聯(lián)性，這也可能與BA的發(fā)生有著重要的聯(lián)系。

2. miRNA與免疫炎癥反應(yīng) 目前認(rèn)為，BA中的免疫反應(yīng)是由病毒或毒素等啟動因素對膽管上皮細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致抗原變異或表達(dá)新的抗原，并由抗原提呈細(xì)胞呈遞給初始T細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)一系列免疫炎癥反應(yīng)所致。其中一種學(xué)說認(rèn)為，γ干擾素(IFN-γ)可以降低T淋巴細(xì)胞激活所需的抗原閾值，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞自身反應(yīng)性激活，并促使其向Th1類細(xì)胞分化，活化的CD4+Th1細(xì)胞分泌更多的IFN-γ，最終誘導(dǎo)嚴(yán)重的免疫應(yīng)答，引起肝內(nèi)外膽管損傷[8]。而其中miRNA能夠參與免疫細(xì)胞分化以及細(xì)胞因子釋放等多種過程的調(diào)節(jié)，為研究BA的機制及治療手段提供了幫助[3]。

Hsu[9]與Zhao[10]先后發(fā)表文獻(xiàn)報道,小鼠BA模型受γ干擾素刺激后，miR-55的表達(dá)水平升高，隨后促進(jìn)MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、CXCL9等細(xì)胞因子表達(dá)，最終通過Jak通路活化了炎癥因子以及STAT1，從而增強了免疫炎癥的作用，這可能是miR-155參與IFN-γ免疫反應(yīng)誘導(dǎo)BA發(fā)生的機制之一。2007年有研究指出，miR-181a的表達(dá)上調(diào)能夠增加T細(xì)胞對抗原的親和力，并且調(diào)控CD4+T細(xì)胞的增殖[11]。因此miR-181能夠通過調(diào)控CD4+T細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。這些研究表明，對miRNA與免疫炎癥反應(yīng)機理的進(jìn)一步研究有望成為未來治療BA的有效方法之一。

3. miRNA與肝纖維化 肝纖維化是BA的重要病理改變之一，成功應(yīng)用Kasai手術(shù)的患者中最終仍有70%會發(fā)展為肝硬化。而肝星狀細(xì)胞被認(rèn)為是肝臟中最主要的導(dǎo)致纖維化的細(xì)胞，它們的活化是纖維化過程中的重要環(huán)節(jié)。靜止的肝星狀細(xì)胞在炎癥和細(xì)胞因子的作用下被激活后，遷移至受損部位轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。而肝內(nèi)細(xì)胞也可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一過程轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[12]。目前研究已發(fā)現(xiàn)部分miRNA與肝纖維化的形成相關(guān)。

研究表明，BA患者肝組織中的miRNA表達(dá)水平與肝纖維化形成相關(guān)。Shen等[13]通過檢測發(fā)現(xiàn)BA患者中miR-21表達(dá)水平升高，并且能夠通過miR-21/PTEN/AKT軸提高α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展。與此同時，Ye等[14]研究表明miR-145表達(dá)水平明顯降低，可能通過高表達(dá)聚攏蛋白3(adducin3，ADD3，已被鑒定為BA易感基因)來促進(jìn)BA患者的肝纖維化。Dong等[15]也證實了BA組織中miR-222表達(dá)水平的增高，并且LX2人肝星狀細(xì)胞系驗證了miR-222能夠通過B組蛋白磷酸酶2A和Akt蛋白激酶的作用，顯著提升星狀細(xì)胞的增殖能力，從而促進(jìn)肝纖維化的形成。此外，miR-222促進(jìn)肝纖維化的功能也在小鼠BA模型中得到了驗證[16]。除miR-222外，也有研究報道m(xù)iR-200b能夠增強Akt的磷酸化，顯著增強LX-2細(xì)胞的增殖和遷移能力，從而可能在肝纖維化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。Shen等[18]在活化的肝星形細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-19b的表達(dá)水平降低，且miR-19b能夠影響下游的轉(zhuǎn)化生長因子表達(dá)，進(jìn)一步影響前膠原的合成，因而認(rèn)為miR-19b可能參與了BA相關(guān)的纖維化。此外，Wang等[19]證實了miR-29c的表達(dá)水平升高或miR-129-5p的表達(dá)水平降低都能夠通過調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)通路的相關(guān)蛋白阻止小鼠BA模型中EMT的發(fā)生，延緩肝纖維化進(jìn)程，為治療BA的新靶點提供了參考依據(jù)。

(二)miRNA診斷BA預(yù)后的價值

近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA可以穩(wěn)定存在于血清或血漿中，因而能夠通過一定手段進(jìn)行檢測，作為BA診斷或預(yù)后的評價指標(biāo)之一。Zahm等[20]通過與膽汁淤積患者比較發(fā)現(xiàn)，BA患者血清中miR-200b/429簇顯著升高，有望成為未來的臨床診斷指標(biāo)之一。且miR-200b/429簇的功能可能與肝外膽管的破壞相關(guān)。前文中談及miR-21與肝纖維化的關(guān)系，然而在Goldschmidt等[21]的研究中，BA患者的循環(huán)miR-21雖然顯著升高，但與肝纖維化并無密切關(guān)系。

Dong等[22]研究表明，BA患者血清中miR-4429表達(dá)水平明顯降低，受試者曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.789，靈敏度、特異度分別達(dá)83.33%及80%；血清miR-4689的表達(dá)水平升高，AUC為0.722，靈敏度、特異度分別達(dá)66.67%和80%。Peng等[23]證實,與非BA膽汁淤積病人比較，BA患者miR140-3p表達(dá)顯著降低，AUC為0.75，靈敏度和特異度分別達(dá)66.7%和79.1%。Shan等[24]發(fā)現(xiàn)miR499 的rs3746444 A>G多態(tài)性可能是肝移植后BA患者疾病風(fēng)險增高以及更長恢復(fù)期的基因決定因素，能夠作為判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。

二、DNA甲基化

DNA甲基化是哺乳動物基因組中常見的表觀遺傳機制，主要通過DNA甲基化酶(例如DNMT家族等)使得特定基因的CpG位點甲基化，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，影響基因表達(dá)[25]。近年來與BA相關(guān)的DNA甲基化研究大多與免疫炎癥反應(yīng)與肝纖維化研究相關(guān)。

(一)DNA甲基化參與BA發(fā)病的可能機制

1. T細(xì)胞相關(guān)機制 既往研究認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞在BA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而Dong等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，從BA患者身上提取的CD4+T細(xì)胞的基因組DNA表現(xiàn)出了低甲基化。在BA患者CD4+T細(xì)胞中，除DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a的mRNA水平均顯著降低外，甲基-DNA結(jié)合域蛋白(methyl-DNA-binding domain proteins，MBD1)的表達(dá)水平也顯著降低，這證實了其基因組DNA的低甲基化水平。此外，γ干擾素的mRNA水平也顯著增加，且其基因啟動子區(qū)也呈低甲基化，說明IFN-γ的表達(dá)與DNA甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。這表明CD4+T細(xì)胞中基因組甲基化水平的變化可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子(如IFN-γ等)的表達(dá)，從而造成BA的發(fā)生及進(jìn)展。

研究表明，CD11a在BA患者的CD4+T細(xì)胞上呈現(xiàn)明顯的低表達(dá)，這與CD11a啟動子區(qū)域的超甲基化是相關(guān)的[27]。運用DNA甲基化抑制劑可以降低CD11a啟動子的甲基化，并提高CD11a的mRNA水平。因此，可以證明CD11a基因座的DNA超甲基化導(dǎo)致了CD4+T細(xì)胞上CD11a的低表達(dá)。

Li等[28]報道了在BA患者及小鼠模型提取的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)中，F(xiàn)oxp3啟動子區(qū)域內(nèi)CpG島的甲基化水平均升高，并且注射了DNA甲基化抑制劑藥物的BA小鼠出現(xiàn)了BA表型的緩解。因而Foxp3啟動子的甲基化狀態(tài)異?？赡軐?dǎo)致Treg抑制免疫炎癥的功能受損，進(jìn)而加劇BA中的炎癥性損傷。這些研究表明在免疫細(xì)胞方向上，關(guān)于DNA甲基化的研究能夠進(jìn)一步揭露BA的發(fā)病機制。

2. 細(xì)胞因子相關(guān)機制 如前文所述，IFN-γ在BA發(fā)病過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Mattgews等[29]在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)，由基因或藥物抑制引起的DNA甲基化能夠造成肝內(nèi)膽管缺損及肝內(nèi)γ干擾素通路基因的高表達(dá)。并且，與其他膽汁淤積性患者相比，從BA患者提取的膽管細(xì)胞中DNA甲基化顯著減少。由此可以推斷，γ干擾素信號通路的表觀遺傳學(xué)活化是BA肝內(nèi)膽管缺損的普遍病因機制。在Cui等[30]的另一項研究中，他們在斑馬魚中驗證通過抑制DNA甲基化能夠增加γ干擾素的表達(dá)，并且給發(fā)育中的斑馬魚注射γ干擾素可以造成膽管缺損，而這些缺損與膽管細(xì)胞增生的減緩相關(guān)。在最近的研究中，Yang等[31]發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b/142-5p的表達(dá)水平升高，能夠靶向抑制DNMT1表達(dá)，從而降低全基因甲基化的水平，進(jìn)一步導(dǎo)致了甲基化敏感的γ干擾素基因表達(dá)水平升高，最終升高了γ干擾素的水平。由此提示細(xì)胞因子相關(guān)的DNA甲基化在BA的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

3. 其他相關(guān)研究 Cofer等[32]利用甲基化芯片技術(shù)，證實了BA組織中血小板源性生長因子A(platelet derived growth factor A，PDGFA)基因座是最顯著的低甲基化區(qū)域，同時也發(fā)現(xiàn)了PDGFA蛋白特異分布于人的膽管細(xì)胞中。他們將PDGFA蛋白二聚體注入斑馬魚體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)DGFA蛋白二聚體能夠引起發(fā)育性和功能性的膽管缺損。此外，在斑馬魚中Hedgehog通路的激活也能引起PDGFA的表達(dá)增加，提示DNA去甲基化是一個能夠調(diào)節(jié)BA相關(guān)基因過表達(dá)的特異因素，也提示PDGFA可能促進(jìn)BA的發(fā)展。

(二)DNA甲基化與BA的診斷預(yù)后

Udomsinprasert等[33]通過對外周血白細(xì)胞的重復(fù)元件的甲基化水平測量，證明了全基因甲基化、8-OHdG以及相對端粒長度之間的關(guān)系，并報道了BA患者中Alu和LINE-1(long interspersed nuclear element-1)存在顯著的低甲基化，且甲基化降低與患者的預(yù)后不良相關(guān)。隨后他們又通過對外周血白細(xì)胞及肝組織的分析發(fā)現(xiàn)，BA患者中autotaxin(ATX)啟動子可見特異性CpG甲基化減少，并且晚期患者ATX啟動子甲基化的水平低于早期患者[34]。此外與對照組相比，BA患者的ATX表達(dá)明顯升高。因此，外周血ATX以及啟動子甲基化的水平能夠用來評估術(shù)后BA患者肝纖維化的進(jìn)展，且ATX的高水平表達(dá)以及啟動子的低甲基化可能參與了BA肝纖維化的進(jìn)展。

三、表觀遺傳學(xué)研究的其他方面

除miRNA及DNA甲基化以外，表觀遺傳學(xué)研究較多的方向還有組蛋白修飾、環(huán)狀RNA(circle RNA,circ-RNA)以及長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA,LncRNA)等，但目前研究中，這些方向上關(guān)于BA的研究較前述為少。

(一)組蛋白修飾

組蛋白修飾是指組蛋白N端的共價修飾，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。通過相對應(yīng)的酶類進(jìn)行修飾后，組蛋白可能參與了轉(zhuǎn)錄阻遏調(diào)節(jié)等途徑，對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。其中組蛋白乙?；敖M蛋白甲基化是組蛋白修飾研究的重要組成部分[35,36]。Barbier等[37]研究表明prohibitin-1(PHB1)在膽汁淤積性肝損傷中起著重要的調(diào)節(jié)作用。PHB1通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 4，HDAC4)的活性來控制特異的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，最終促進(jìn)肝損傷以及纖維化。而組蛋白甲基化修飾的BA相關(guān)研究目前尚未見報道，但組蛋白修飾在BA的病理進(jìn)程中應(yīng)該起著一定的作用。

(二)LncRNA

LncRNA是指核苷酸數(shù)量超過200個的RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能。LncRNA能夠通過增強或阻遏轉(zhuǎn)錄因子、增強子、沉默子等以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯及修飾等途徑，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[38]。Nuerzhati等[39]研究發(fā)現(xiàn)BA患者肝組織中LncRNA膜聯(lián)蛋白A2假基因3(Annexin A2 pseudogene 3，ANXA2P3)表達(dá)升高，并證實ANXA2P3能夠通過膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)減少肝細(xì)胞凋亡，這可能對BA患者的肝損傷進(jìn)展具有保護(hù)作用。

LncRNA H19在人類肝臟疾病和多個膽汁淤積性肝損傷動物模型中被報道上調(diào)，包括CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷、BDL誘導(dǎo)的膽汁淤滯損傷等模型，這說明H19在膽汁淤積性肝損傷疾病進(jìn)展中具有重要作用[40,41]。而Xiao等[42]通過研究LncRNA H19在BA發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用，表明H19能夠通過調(diào)節(jié)S1PR2/SphK2和let-7/HMGA2信號通路，促進(jìn)膽管細(xì)胞的增殖和肝纖維化。

(三)其他

近年來表觀遺傳學(xué)研究熱點還包括6-甲基腺瞟吟(N6-methyladenosine，m6A)，這是真核細(xì)胞生物中信使RNA (messenger RNA，mRNA)最為常見的一種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾，在mRNA剪接、穩(wěn)定性、出核轉(zhuǎn)運及RNA與蛋白質(zhì)相互作用等方面有重要作用[43,44]。另一熱點是環(huán)狀RNA(circular RNA，circ RNA)，它能夠通過對miRNA的調(diào)控進(jìn)而影響細(xì)胞功能[45]。雖然m6A甲基化及circ RNA很有可能在BA的發(fā)生發(fā)展中起著作用，但目前的研究中尚未報道二者在BA中有何功能。

四、小結(jié)

近年來表觀遺傳學(xué)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，其相關(guān)方面均可能在BA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。表觀遺傳學(xué)的改變可以在特定的方法下測出，因而能夠在BA的診斷以及預(yù)后評價方面發(fā)揮重要作用，例如miRNA以及DNA甲基化水平未來可能成為BA臨床診斷及預(yù)后評價的有效指標(biāo)。表觀遺傳學(xué)的某些改變具有可逆性，能夠通過特定方式進(jìn)行改變，這為表觀遺傳學(xué)在治療學(xué)上的應(yīng)用提供了極大的可能[46-48]。

表觀遺傳學(xué)涉及多方面的基因調(diào)控環(huán)節(jié)，而各方面的調(diào)控并非各自獨立，如肝纖維化機制中LncRNA、miRNA及DNA甲基化之間的相互作用。也有文獻(xiàn)報道，RNA之間也存在競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控機制：LncRNA/circRNA能夠通過競爭性結(jié)合miRNA，從而調(diào)控miRNA對mRNA的抑制作用[49]。雖然目前BA關(guān)于組蛋白修飾、LncRNA、circ RNA和m6A甲基化的研究較少，但其可能與miRNA、DNA甲基化等相互交叉發(fā)揮作用。因此，進(jìn)一步深入研究并構(gòu)建BA的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將會是接下來的研究重點。表觀遺傳學(xué)的深入研究將為BA的診斷、預(yù)后評估以及治療帶來新的希望。