LncRNA與成骨分化相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展

劉巖，趙志軍，馮士軍，韓彥軍，張春陽

骨骼是形成人體支持框架、參與各種生理功能的高度功能化的結(jié)締組織，如調(diào)節(jié)血液酸堿度、鈣和磷酸鹽水平等；顱骨是機(jī)體骨骼系統(tǒng)的重要組成部分之一。骨組織的細(xì)胞成分主要包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞[1]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是骨代謝中成骨過程與破骨過程中的重要功能細(xì)胞，其中成骨細(xì)胞的作用是骨的形成，而破骨細(xì)胞的作用是骨的吸收，主要參與骨基質(zhì)的合成、分泌、礦化的過程[2]。而成骨細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的過程，受轉(zhuǎn)錄因子Runx2、p57和Sp7等的嚴(yán)格控制，調(diào)控著大量關(guān)鍵下游促成骨靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)可通過復(fù)雜機(jī)制網(wǎng)絡(luò)調(diào)控成骨標(biāo)志物或關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子及相關(guān)途徑參與骨生成；其在體內(nèi)的表達(dá)水平失調(diào)與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。LncRNA在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平參與了調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞組織功能，促進(jìn)細(xì)胞增殖，如成骨細(xì)胞的分化。在癌基因或抑制基因表達(dá)中，LncRNA也起著調(diào)節(jié)作用[4]，調(diào)控癌癥(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肺癌等)發(fā)生發(fā)展的相關(guān)生物過程[5]，可作為診斷、治療及判定預(yù)后的生物標(biāo)志物。目前，對于LncRNA在成骨過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的研究日益增多；其中Wnt/β信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(TGF-β/BMP)、Notch及Hedgehog信號通路等備受關(guān)注?，F(xiàn)對LncRNA及其通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路進(jìn)而調(diào)控成骨細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞形成骨的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為顱骨缺損病變(尤其是小兒顱骨缺損)的修復(fù)提供新的臨床治療思路和方法。

1 LncRNA的結(jié)構(gòu)與功能及來源

1.1 結(jié)構(gòu)與功能 LncRNA是長度大于200個核苷酸序列、沒有蛋白質(zhì)編碼作用的RNA(non-coding RNA,ncRNA)，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外顯子少，表達(dá)量低，缺少開放閱讀框(open reading frame，ORF)及典型的起始和終止密碼子。大多數(shù)真核細(xì)胞的LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生的；但小鼠熱休克誘導(dǎo)的B2-SINE RNAs[6]，或人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)的NDM29[7]是由RNA聚合酶Ⅲ所合成。LncRNA可參與細(xì)胞的多種生理過程，包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)、信使RNA翻譯的控制、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、胚胎多能性的調(diào)控和分化。在成骨細(xì)胞中，大多數(shù)LncRNA保留在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，如LncRNA-NRON[8]；但有研究發(fā)現(xiàn)某些LncRNA在細(xì)胞質(zhì)中起作用，如lnc-DC[9]；還有一些調(diào)節(jié)性RNA在特定信號或刺激下從胞核向胞質(zhì)傳輸類似的RNA，如反義泛素羧基末端水解酶L1(如UCHL1)LncRNA-UCHL1[10]。

1.2 來源 LncRNA主要有5種來源[11-12]：(1)由于某種原因?qū)е戮幋a蛋白質(zhì)的基因出現(xiàn)斷裂產(chǎn)生；(2)由于一個基因序列與尚未轉(zhuǎn)錄的兩個基因序列發(fā)生重組產(chǎn)生；(3)由于非編碼蛋白質(zhì)基因復(fù)制時發(fā)生反轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生；(4)由于相鄰的復(fù)制子串聯(lián)而產(chǎn)生；(5)由于新的轉(zhuǎn)座子嵌入基因序列產(chǎn)生。按照LncRNA在基因組上對應(yīng)蛋白質(zhì)編碼基因的區(qū)域，可將LncRNA分為5類：(1)正義LncRNA；(2)反義LncRNA；(3)雙向LncRNA；(4)內(nèi)含子LncRNA；(5)基因間LncRNA。

2 LncRNA與成骨分化過程的相關(guān)信號通路

2.1 Wnt/β信號通路 β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路中調(diào)節(jié)成骨分化的關(guān)鍵因子[13]，Wnt/β信號通路可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化、增殖及功能，直接影響多能干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而且在脂肪細(xì)胞及前脂肪細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的過程中同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用。LncRNA作為一種競爭性內(nèi)源性RNA，與microRNA相互競爭而抑制或促進(jìn)其靶基因Fox O1的表達(dá)，進(jìn)而影響骨形成過程Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)或抑制成骨過程。

Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在人髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cell，NPC)中，LncRNA TUG1通過調(diào)控Wnt/β信號通路，提高β-catenin、Caspase-3、Bax、MMP-3的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2和蛋白多糖的表達(dá)，進(jìn)而抑制NPC凋亡和衰老，促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨細(xì)胞分化。Liang等[15]研究證實(shí)，LncRNA H19正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，其穩(wěn)定表達(dá)顯著加速了成骨細(xì)胞的體內(nèi)外分化；同時LncRNA H19的表達(dá)水平在人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchyma stem cells，hMSCs)成骨過程中明顯上調(diào)；另外，β-catenin是成骨負(fù)調(diào)控因子MiR-141和miR-22的常見靶點(diǎn)，H19通過對抗這兩個microRNA的功能并導(dǎo)致共同目標(biāo)基因的去抑制，最終激活Wnt/β-catenin通路，從而促進(jìn)成骨分化。因此，LncRNA H19主要是通過拮抗miR-22和miR-141的功能，最終激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)體內(nèi)和體外成骨，并增強(qiáng)成骨作用。然而，關(guān)于LncRNA p21對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的影響研究中顯示，沉默LncRNA p21后，通過調(diào)節(jié)Wnt/β信號通路能促進(jìn)BMSCs旁分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子和β-catenin蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞的分化[16]。因此，控制LncRNA表達(dá)可能是治療由Wnt/β信號通路異常引起的成骨分化不良的有效方式。

2.2 TGF-β/BMP信號通路 TGF-β/BMP信號通路可通過經(jīng)典的Smad通路與非經(jīng)典的P38通路調(diào)控BMSCs內(nèi)Runx2基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化；同時其還能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能[17]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是一種多功能蛋白質(zhì)，屬于TGF-β超家族中的一員，具有多種生物學(xué)功能，可參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。BMP最初由Urist發(fā)現(xiàn)，并證明BMP具有誘導(dǎo)骨、軟骨形成及皮下、肌肉等部位異位骨形成的作用[18]。有研究表明，BMP2活化后可以直接作用于下游的Smad5，進(jìn)而激活Smad5發(fā)生磷酸化，之后與Smad4形成復(fù)合體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，最終調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2和OSX的表達(dá)，影響干細(xì)胞的成骨分化[19]。

Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA Bmncr通過維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維調(diào)節(jié)蛋白(fibromodulin，F(xiàn)MOD)和激活BMP2通路來調(diào)節(jié)BMSCs的成骨生態(tài)位；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Bmncr可作為促進(jìn)TAZ與ABL相互作用的支架，從而促進(jìn)TAZ與RUNX2/PPARG轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝，增強(qiáng)成骨作用，抑制脂肪生成；另外，敲除Bmncr的小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)流失加速和骨髓脂肪積累，同時成骨相關(guān)基因Bmp2、堿性磷酸酶1(alkaline phosphatase 1，ALPl)、Runx2、Sp7和Bglap的表達(dá)也下調(diào)；而轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Bmncr可緩解骨質(zhì)流失、抑制脂肪堆積。

miR-17-5p通過直接靶向BMP2調(diào)控人脂肪干細(xì)胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)的成骨分化。在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中miR-17-5p通過靶向SMAD7調(diào)控成骨細(xì)胞分化和增殖[21]。LncRNA HOTAIR與miR-17-5p共享互補(bǔ)序列，HOTAIR通過介導(dǎo)miR-17-5p的表達(dá)來調(diào)控成骨分化標(biāo)志物；HOTAIR下調(diào)可導(dǎo)致BMP-2誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cell-bone marrow，hMSC-BM)的RUNX2和COL1A1 mRNA表達(dá)水平增加，ALP活性升高；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-17-5p模擬物可以逆轉(zhuǎn)HOTAIR上調(diào)引起的RUNX2和COL1A1 mRNA表達(dá)水平的降低及ALP活性降低，而miR-17-5p抑制劑也可以抵消HOTAIR下調(diào)引起的RUNX2和COL1A1 mRNA表達(dá)水平及ALP活性的升高[22]。因此，HOTAIR作為骨分化的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)控miR-17-5p及其靶基因SMAD7的表達(dá)，調(diào)控成骨細(xì)胞分化和增殖的過程。

此前Zhuang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3在BMSCs的在成骨分化過程中起正調(diào)控作用，而在成脂分化過程中起負(fù)調(diào)控作用；其直接與SOX2和BMP4啟動子相互作用，控制SOX2與BMP4啟動子上SOX2共識位點(diǎn)的相互作用，增加BMP4基因的表達(dá)；MEG3過表達(dá)可通過靶向BMP4轉(zhuǎn)錄促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的間充質(zhì)干細(xì)胞(multiple myeloma-mesenchymal stem cells，MM-MSCs)成骨分化，而MEG3的下調(diào)顯著降低了BMP4的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致成骨功能受損。另外在比較了MSC成骨誘導(dǎo)分化前后的差異LncRNA后，發(fā)現(xiàn)LncRNA H19可以通過H19/MiR-675/TGF-β/Smad/HADC通路促進(jìn)成骨分化[24]。

2.3 PI3K/AKT信號通路 PI3K/AKT信號通路是一種廣泛存在于多種組織中的與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在對鼻咽癌的研究中觀察到，LncRNA ZFAS1在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)；在體外ZFAS1可通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖。上調(diào)LncRNA DLX6-AS1表達(dá)通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[25]。而且越來越多的研究表明PI3K/AKT通路可能影響成骨分化[26]。Wu等[27]統(tǒng)計(jì)分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，LncRNA HIF1A-AS2和IL-6在成骨誘導(dǎo)的脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adiposederived stem cells，ASCs)中高表達(dá)；HIF1A-AS2激活了包含IL-6受體的PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)成骨分化；而HIF1A-AS2/IL-6的下調(diào)降低了成骨細(xì)胞標(biāo)志物Runx2、Osterix和骨鈣素的表達(dá)以及ALP的活性，使成骨功能受損。另外，在分子水平上，miR-665抑制IL-6表達(dá)，HIF1AAS2直接靶向miR-665，導(dǎo)致IL-6增加并激活PI3K/AKT信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)成骨分化。因此，HIF1A-AS2/miR-665/IL-6軸共同調(diào)控PI3K/AKT信號通路參與成骨分化過程。

2.4 Notch信號通路 Notch基因編碼一種膜蛋白受體，參與囊泡運(yùn)輸，并介導(dǎo)蛋白相互作用和化學(xué)修飾；Notch可以影響細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的多個過程，如凋亡、增值分化及邊界的形成等。Notch信號通路主要由Notch配體，Notch受體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子結(jié)合蛋白組成，Notch信號通路的激活主要取決于Jagged1配體與Notch1受體之間的結(jié)合，在細(xì)胞發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用。Jin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路參與了成骨細(xì)胞的生理活動，如增殖、侵襲和凋亡的調(diào)控。Wang等研究[29]顯示，通過上調(diào)Notch信號通路中的Notch1表達(dá)并激活Notch信號通路可以明顯促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長和增殖。

2.5 Hedgehog信號通路 Hedgehog(Hh)信號分子是一種由信號細(xì)胞所分泌的局域性蛋白質(zhì)配體，其蛋白質(zhì)家族在胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖中具有至關(guān)重要的功能。Hh信號通路已被公認(rèn)為是各種癌癥中的重要信號通路和治療靶標(biāo)。LncRNA嗜酸性粒細(xì)胞遺傳學(xué)轉(zhuǎn)錄物(eosinophil genetic transcript，EGOT)可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并通過Hh信號通路促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展，還可能通過Hh途徑失活而抑制乳腺癌細(xì)胞的通行性和遷移[30]。LncRNA ASAP1-IT1通過Hh信號通路正調(diào)控膽管癌的發(fā)展[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過Wnt/β-Catenin激活間充質(zhì)干細(xì)胞中Hh信號能夠誘導(dǎo)軟骨和骨腫瘤形成[32]。Runx2對于成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟至關(guān)重要。在成骨細(xì)胞分化過程中，Runx2通過直接調(diào)控Hh、Wnt來增強(qiáng)間充質(zhì)細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其對成骨細(xì)胞分化。以上研究結(jié)果均表明Hh信號通路在骨的生長代謝中具有重要的作用。

3 LncRNA的臨床應(yīng)用

LncRNA參與人體正常生命活動及影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA Hulc在乳腺癌組織中表達(dá)水平增高，miR-9-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)下調(diào)；LncRNA Hulc和miR-9-5p的表達(dá)均與乳腺癌患者的不良病理參數(shù)相關(guān)，且對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測價(jià)值。LncRNA Hulc、miR-9-5p可能為臨床治療乳腺癌提供新的靶點(diǎn)[33]。同時張向陽在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證明，通過調(diào)節(jié)Myc、Lnc-EPIC1表達(dá)可以保護(hù)人成骨細(xì)胞免受地塞米松的損傷[34]。

總之，LncRNA在骨相關(guān)性疾病及調(diào)控骨重建中發(fā)揮了重要作用，但其相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，仍需要大量基礎(chǔ)研究探討。目前對于LncRNA調(diào)控骨重建的研究還處于探索階段，尤其是LncRNA如何調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化還有待進(jìn)一步研究。因此，明確LncRNA作用機(jī)制具有十分重要的意義，通過各種手段干預(yù)相關(guān)特異性的LncRNA在成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化中的作用，可為顱骨修補(bǔ)(尤其是小兒顱骨缺損修補(bǔ))的治療提供新的方向。