外泌體在急性心肌梗死診療中的研究進展

王佳怡，莊少偉

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200137)

1983年，Pan等[1]在體外培養(yǎng)綿羊網(wǎng)織紅細胞時發(fā)現(xiàn)一種從未發(fā)現(xiàn)的細胞外囊泡，1987年被命名為外泌體[2]。作為一種傳遞信號的介質(zhì)，外泌體在細胞與細胞間、細胞與組織間起到了多種調(diào)控作用，并在心血管疾病中扮演著重要的角色。

在心血管疾病如冠狀動脈粥樣硬化型心臟病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)過程中，外泌體的介導(dǎo)作用是一把雙刃劍，既可導(dǎo)致心肌細胞損傷[3-7]，也可產(chǎn)生心肌保護作用，這與外泌體來源細胞的種類和誘導(dǎo)因素相關(guān)。如血管平滑肌細胞外泌體會介導(dǎo)miR-155破壞血管內(nèi)皮，而單核巨噬細胞受尼古丁誘導(dǎo)后產(chǎn)生的外泌體會促進血管平滑肌細胞遷移及增殖，延緩冠脈狹窄的進展[8-9]。

根據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2019》，CAD是我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡的首要原因，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的死亡率呈快速上升趨勢[10]。由于冠狀動脈粥樣斑塊破裂形成的血栓堵塞或冠脈痙攣等原因，冠狀動脈發(fā)生急性、持續(xù)性閉塞，從而導(dǎo)致心肌血供不足，心肌細胞缺血缺氧，因而AMI有著起病急、進展快、預(yù)后差的特點。目前AMI的治療手段以溶栓和介入治療為主，即使及時接受了治療，患者仍可能遭受心臟破裂、心律失常、心力衰竭或心源性休克等并發(fā)癥的折磨，心源性猝死風(fēng)險大大提升[11-13]。因而研究外泌體介導(dǎo)AMI的作用機制，有助于了解AMI病理生理過程，以利開發(fā)新的診療方式。

已有眾多報道表明外泌體在AMI后心臟具有修復(fù)作用[14-16]，外泌體在臨床應(yīng)用中具有巨大潛力，有望為防治心臟疾病開辟一條蹊徑。

1 外泌體介導(dǎo)細胞間通訊影響心肌梗死

1.1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體形態(tài)呈杯狀，直徑為50～150 nm，具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[17]。外泌體通過旁分泌途徑傳遞信息，其起源于多囊體(multivesicular bodys, MVBs)產(chǎn)生的腔內(nèi)囊泡，在與質(zhì)膜融合后向胞外分泌[18]，釋放受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mechanistic target of rapamycin complex 1, mTORC1)開關(guān)調(diào)節(jié)[19]。

靶細胞通過內(nèi)吞途徑攝取外泌體。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外泌體內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用、小窩蛋白依賴性內(nèi)吞作用、大胞飲作用、吞噬作用以及脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等[20-23]。在對大鼠乳鼠來源的心肌成纖維細胞、心肌細胞和小鼠骨髓來源樹突狀細胞的通訊觀察中發(fā)現(xiàn)，靶細胞對外泌體的吞噬具有選擇性，外泌體的內(nèi)吞作用通過受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機制實現(xiàn)[7,24]。研究外泌體釋放和攝取的機制有助于解析其在細胞間的作用機制，為外泌體介導(dǎo)和干預(yù)AMI發(fā)病機制指明新方向。

外泌體通過轉(zhuǎn)運內(nèi)含物傳遞細胞間信號，從而參與體內(nèi)多種生理及病理過程，如介導(dǎo)細胞死亡、調(diào)節(jié)炎癥過程、促進病毒傳播等[25-29]。目前已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含物種類包含核酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等，其中含RNA超過10 000種，RNA是外泌體中最主要的信號傳遞分子[30]。

不同來源的外泌體在不同的機體環(huán)境下所產(chǎn)生的作用也不盡相同[7]。對外泌體內(nèi)含物參與的信號通路的解密，有助于揭露外泌體介導(dǎo)AMI過程的相關(guān)機制。

1.2 外泌體中的RNA轉(zhuǎn)運

外泌體可以將囊泡內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)運到靶細胞中，其RNA種類十分豐富，包括miRNA、lncRNA、cRNA、siRNA等，但目前研究主要集中于miRNA和lncRNA。外泌體同樣運載DNA，但鮮有報道其生物學(xué)意義。

1.2.1 外泌體miRNA在AMI中的作用 AMI發(fā)生后心肌細胞因缺血缺氧受到損傷，雖然適時溶栓或介入治療降低了AMI死亡率，但無法逆轉(zhuǎn)梗死區(qū)心肌細胞的受損及纖維化的發(fā)展，而外泌體miRNA介導(dǎo)AMI后修復(fù)方式是近5年研究熱點之一。AMI后再灌注過程中，心臟成纖維細胞通過miR-423-3p抑制RAP2C，增強心肌細胞對復(fù)氧的耐受，同時心肌球細胞外泌體中的miR-181b可通過miRNA與蛋白質(zhì)的協(xié)同作用抑制促凋亡蛋白PKCδ，阻止心肌細胞發(fā)生凋亡[31-32]。AMI后血清中的循環(huán)外泌體可以通過富集miR-1956激活脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的釋放，同時下調(diào)miR-939-5p表達從而增強iNOS-NO活性，促進血管新生[33-34]。此外，胚胎干細胞分泌的外泌體中miR-294靶向修復(fù)受損心肌細胞，增強梗死后心臟的功能[35]。但是AMI后巨噬細胞外泌體通過傳遞促炎信號加重心肌損傷，這些外泌體miRNA(如miR-155或miR-182)表達下降能夠靶向抑制巨噬細胞，逆轉(zhuǎn)AMI后心臟重構(gòu)[4,36-37]。由此可見不同細胞外泌體miRNA對AMI后修復(fù)作用不盡相同。

1.2.2 外泌體lncRNA在AMI中的作用 目前已知的外泌體lncRNA對心臟的保護作用大多建立在干細胞相關(guān)研究中，需與miRNA協(xié)同發(fā)生。如人骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體中的lncRNA KLF3-AS1通過miR-138-5P/SIRT1軸抑制AMI過程中心肌細胞的焦亡[26]。在動物實驗中，大鼠間充質(zhì)干細胞的lncRNA-UCA1通過靶向miR-873，解除對抗凋亡因子XIAP的抑制作用后同時增加抗凋亡蛋白BCL2的表達，從而維持細胞生存[38]。阿托伐他汀作為降膽固醇藥物，在AMI治療中起到關(guān)鍵作用，阿托伐他汀預(yù)處理后的大鼠間充質(zhì)干細胞會以lncRNA H19為媒介促使miR-675表達，激活血管內(nèi)皮生長因子和細胞黏附分子-1(cell adhesion molecule-1, CAM-1)，從而促進血管新生，同時抑制心肌細胞凋亡[39]。

1.3 外泌體中蛋白質(zhì)對心肌有保護作用

研究表明，外泌體內(nèi)裝載的蛋白有心臟保護作用。從成年雄性大鼠和健康的人類男性志愿者的血液中純化出外泌體，外泌體攜帶的熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)通過刺激Toll樣受體4(Toll-like receptors 4, TLR4)信號通路激活HSP27，從而保護受損心肌[40]。

向AMI小鼠心肌內(nèi)注射富含白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的小鼠心臟內(nèi)皮細胞外泌體，顯著改善了左心室心功能，抑制了細胞凋亡，減小了MI瘢痕大小，促進了MI后新血管生成，而注射敲除了IL-10的小鼠心臟內(nèi)皮細胞外泌體顯示出了完全相反的治療效果[41]。

2 外泌體具有成為AMI診斷標志物的潛力

臨床上用于確診AMI的血清學(xué)指標主要是肌鈣蛋白(troponin, Tn)I或T。其中TNI在AMI起病3～4 h后方才升高明顯，因此以TNI為診斷指標可能會錯過AMI治療的最佳時機[11-12]。此外，其他非AMI因素心肌損傷也可導(dǎo)致TNI升高，對臨床診斷工作會造成一定干擾。因此迫切需要更多AMI早期診斷標志物用于臨床診斷。眾多研究證據(jù)表明，外泌體中的miRNA和lncRNA可為AMI早期診斷提供新的依據(jù)。

對AMI患者血清和血漿進行檢測，會發(fā)現(xiàn)心肌細胞來源的miR-1、miR-133、miR-208和miR-499表達量升高[42-44]。而在AMI小鼠模型中驗證確定外泌體miR-1a、miR-208a和miR-499-5p在血液循環(huán)中升高，而血漿中的非外泌體部分可檢出升高的miR-133a[42]。此外，AMI患者循環(huán)外泌體中還存在miR-126、miR-183和PTEN基因的高表達，lncRNA-UCA1、lncRNA-NEAT1和lncRNA MMP-9等lncRNA含量也較常人更豐富，而miR-21、miR-204的表達量有所下調(diào)[38,45-47]，其中，miR-126、miR-183的高表達與患者的心肌缺血程度呈正相關(guān)[45-46]。因此，外泌體中的miRNA和lncRNA具有預(yù)測心肌缺血損傷程度和診斷AMI的潛力。AMI后1年內(nèi)發(fā)作心力衰竭的患者血清中檢測出了高表達的miR-192，患者血清外泌體中的miR-194及miR-34a的表達與之協(xié)同上調(diào)，這3種miRNA具有預(yù)測AMI后1年內(nèi)發(fā)生心力衰竭的潛力[48]。

3 利用外泌體有望成為AMI治療新方式

AMI往往導(dǎo)致心肌長時間缺血缺氧，致使心肌細胞形成不可逆的損傷和壞死[49]，因此對外泌體的利用主要聚焦于對再灌注后受損心肌的修復(fù)，治療思路為阻斷損傷性外泌體的攝取、增強治療性外泌體的傳遞[50-51]。

在相關(guān)的研究中，往往將外泌體與基因工程相結(jié)合，借助外泌體對基因的運載和釋放功能，從基因?qū)用鎸崿F(xiàn)對AMI的靶向治療[52-53]。例如過表達低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)可上調(diào)心臟內(nèi)皮細胞分泌的外泌體中的miR-126和miR-210表達量，其中miR-126上調(diào)Vegfa和Fgf2基因的表達，促進血管新生，而miR-210降低線粒體代謝，從而提升被移植的心臟祖細胞的存活率[54]。

在此基礎(chǔ)上，以外泌體為載體，將外泌體與利于心肌修復(fù)的信號分子整合為治療用藥，可以減少信號分子在體內(nèi)的代謝消耗，定向、定量、靶向AMI區(qū)域局部給藥[50-52]。Song等[53]通過向梗死區(qū)心肌注射外泌體，將裝載的外源性miR-21導(dǎo)入AMI小鼠心肌細胞和內(nèi)皮細胞，從而大大抑制了細胞凋亡，使心功能得到明顯改善。北卡羅來納州立大學(xué)陳柯團隊[55]直接向AMI大鼠梗死心肌區(qū)域內(nèi)注射人正常心臟組織來源的外泌體，發(fā)現(xiàn)其能夠阻止小鼠左心室射血分數(shù)下降，減輕AMI后心臟重塑。

在大型動物模型中，局部外泌體注射治療的療效也得到了驗證。美國西奈山醫(yī)學(xué)院Eduardo Marban研究組將外泌體對心臟的保護作用在豬AMI模型上進行了驗證。Eduardo Marban研究組[32]構(gòu)建了大鼠和豬的AMI模型后，向兩種模型的心肌梗死區(qū)均注射了人心肌球衍生細胞源外泌體，結(jié)果顯示梗死區(qū)域瘢痕減小，減輕不利的重塑，且改善梗死后左心室射血分數(shù)。美國阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校張建一教授和國內(nèi)同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院高崚團隊合作[50]，同樣構(gòu)建了豬AMI模型，報道了由人誘導(dǎo)多能干細胞(hiPSCs)衍生的心臟細胞外泌體于心臟梗死區(qū)域注射治療后，可改善梗死豬心臟的細胞能量代謝，改善了豬AMI模型的心臟功能并限制了不良重塑，并且不會增加心律失常并發(fā)癥的發(fā)生率，為心肌損傷提供了無細胞治療的新選擇。

兩方團隊都嘗試冠脈內(nèi)注射予藥，然而療效則無，這提示外泌體治療的予藥需集中在梗死局部，減少體內(nèi)循環(huán)代謝對外泌體的消耗。對此，亦有研究提出通過利用磁性吸附的原理，局部募集外泌體，使之在梗死區(qū)域釋放的可能性，并在不同動物AMI模型中予以了嘗試[56]。

4 外泌體可提高干細胞移植存活率

干細胞移植是AMI后心肌修復(fù)治療的前沿研究方向[57]，在動物實驗中已證明干細胞能夠幫助AMI后梗死區(qū)心肌組織再生和修復(fù)，但是移植后細胞存活率不高，嚴重制約了干細胞移植的臨床應(yīng)用[50-54]。

心肌內(nèi)注射人胚胎干細胞來源的心臟祖細胞外泌體或小鼠胚胎干細胞外泌體同樣可以改善小鼠AMI后心功能[13,35]，既能收獲與干細胞移植同等的效益，又可以規(guī)避干細胞移植存活率低的局面。

外泌體還可以用于抑制干細胞移植治療后發(fā)生的免疫反應(yīng)，減輕移植后排斥反應(yīng)。人臍帶間充質(zhì)干細胞通過miR-24/Bim途徑降低了移植后排斥反應(yīng)，從而提高移植細胞生存率[58]。

5 展 望

目前外泌體在AMI等心血管疾病中的研究尚處在起步階段，集中于外泌體在細胞和組織水平上通訊載體功能，主要圍繞著AMI過程中的炎癥反應(yīng)、梗死面積的加重等損傷過程，抑或是減少心肌細胞死亡、刺激血管新生等的保護機制,具有診斷和治療AMI的潛力。

由于外泌體粒徑單位只有納米級別，在電荷、粒徑大小上都很難與其他細胞囊泡或者成分分離，因而如何分離和純化外泌體一直是研究中的一大難題。依托于科學(xué)技術(shù)的進步，外泌體的檢測方法也得到發(fā)展[56,59-60]，如特異性配體受體結(jié)合或者磁珠捕捉法、納米流式分析系統(tǒng)、原子力顯微紅外光譜儀等，從而簡化外泌體的定性定量流程[60-63]。微流控外泌體捕捉芯片，因其對外泌體樣品需求量小、檢測靈敏度高，具有成為健康檢測和疾病診斷工具的潛能[64-65]。有研究團隊以仿生外泌體粒子為靈感，通過技術(shù)手段人為建造外泌體模擬納米囊泡，提升了其可控性和可修飾性，在外泌體的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)革命性突破[66-68]。

隨著外泌體檢驗技術(shù)的發(fā)展，其檢驗手段已經(jīng)初步具備臨床檢驗的能力，因此外泌體具有良好的臨床應(yīng)用前景，值得受到更多研究者的關(guān)注。