彭 燕,唐 奇綜述,馮振卿審校
Siglec-9是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin,Siglec)家族的成員之一,通常表達于中性粒細胞、單核巨噬細胞、CD56+NK細胞,以及少量正常T細胞膜表面。Siglec-9通過識別含有唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu),參與細胞之間或細胞與病原體之間的相互作用,對機體先天性免疫和獲得性免疫具有抑制作用。越來越多的證據(jù)表明,Siglec-9在腫瘤發(fā)展中具有重要作用,研究發(fā)現(xiàn)Siglec-9不僅可促進腫瘤的增殖侵襲轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成,還可負(fù)調(diào)控免疫微環(huán)境。這些發(fā)現(xiàn)給腫瘤治療提供了一個新的靶點,近年來已逐步開展針對Siglec-9的腫瘤免疫治療。本文將對Siglec-9的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能以及在腫瘤靶向治療和影像診斷中的作用作一綜述。
1.1 Siglec-9的基本結(jié)構(gòu)Siglecs按序列保守程度可分為兩大類:一類是序列可變的CD33相關(guān)性Siglecs,另一類是序列保守的經(jīng)典型Siglecs。人源Siglecs有15種,CD33相關(guān)性Siglecs包含有Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-9等11種,經(jīng)典型Siglecs分別是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4以及Siglec-15等4種。鼠源Siglecs有9種,其中CD33相關(guān)性Siglecs包括Siglec-3,Siglec-E、Siglec-F、Siglec-G以及Siglec-H,經(jīng)典型Siglecs同人源的4種類型一樣,并且Siglec-E與人源性Siglec-9屬于同源物,常用Siglec-E替代研究Siglec-9的功能[1]。
Siglec-9基因位于人19號染色體,由七個外顯子和六個內(nèi)含子組成,編碼區(qū)含有1392個核苷酸。Siglec-9是Siglec-9基因編碼的單次I型跨膜蛋白,含463個氨基酸,分子量大小為50 Kda左右,特異性表達于髓系細胞和免疫細胞的細胞膜表面[2-3]。Siglec-9胞外區(qū)包含3個Ig樣結(jié)構(gòu)域,分別是1個V-set Ig樣結(jié)構(gòu)域和2個C2-set樣結(jié)構(gòu)域[2]。其中V-set結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R別唾液酸具有重要作用,它包含兩個對識別唾液酸有重要影響的氨基酸殘基,分別是β鏈中的精氨酸和色氨酸,這些殘基可分別與唾液酸的羧基和甘油狀側(cè)鏈直接相互作用[4]。胞質(zhì)區(qū)內(nèi)有兩個保守的含酪氨酸的基序,分別是基于酪氨酸的免疫受體抑制基序(immune receptor tyrosine - based inhibitory motif, ITIMs)和SLAM樣基序。其中ITIM與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),磷酸化后可招募酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,調(diào)節(jié)機體的天然免疫和獲得性免疫。此外,膜近端基序的突變還可增加Siglec-9的唾液酸結(jié)合活性[5]。
1.2Siglec-9的生物學(xué)功能中性粒細胞上Siglec-9的表達較高,作為抑制性唾液酸受體,可調(diào)節(jié)中性粒細胞死亡。研究表明Siglec-9可對磷脂酰絲氨酸再分配并加速DNA的裂解,其表達與中性粒細胞的自發(fā)性凋亡呈正相關(guān)。且在促炎因子GM-CSF、IFN-S、IFN-γ的作用下,Siglec-9還可介導(dǎo)中性粒細胞的自噬性死亡,細胞發(fā)生胞質(zhì)空泡化,線粒體腫脹等改變[6-7]。
Siglec-E和Siglec-9是不同種屬間結(jié)構(gòu)相似,功能相同的直系同源物,主要表達于小鼠中性粒細胞和巨噬細胞表面。當(dāng)中性粒細胞上的β整合素與纖維蛋白原或其他β整合素配體連接后,Siglec-E會與β整合素配體上的唾液酸以唾液酸依賴的方式相結(jié)合,與配體結(jié)合后的Siglec-E可能對β整合素下游信號通路產(chǎn)生影響,如抑制Syr Tyr317的磷酸化和p38 MAPK的激活以及激活β整合素觸發(fā)的Akt和產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS),從而正向調(diào)節(jié)還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性和ROS的產(chǎn)生[8]。ROS作為抗炎因子可抑制中性粒細胞的遷移和募集,保護炎癥組織免受中性粒細胞過度募集造成的損傷,故而Siglec-9表達水平的增加對于如慢性阻塞性肺疾病、慢性鼻炎等炎癥的控制具有積極作用[9-10]。此外,Siglec-E還參與脂多糖刺激引起的TLR4反應(yīng)負(fù)調(diào)控以及大腸桿菌誘導(dǎo)的TLR4內(nèi)吞[11]。
TCR是T細胞表面受體,通過識別特異性抗原肽,引起下游信號通路的活化。Siglec-9僅在少數(shù)T細胞亞群中表達,與Siglec-9配體結(jié)合后,會對TCR信號產(chǎn)生負(fù)調(diào)控。在TCR受到刺激后可增強Siglec-9的酪氨酸磷酸化以及ITIM基序?qū)HP-1的招募,降低ZAP70上319位酪氨酸的磷酸化,從而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少和活化T細胞核因子轉(zhuǎn)錄活性降低,抑制T細胞的活化[12]。Siglec-9除了促進細胞凋亡,調(diào)節(jié)細胞遷移和活化外,還可通過ITIMs基序促進巨噬細胞分泌抗炎因子IL-10,減少促炎因子的生成[13]。
Siglec-9還可調(diào)節(jié)Treg/Th17細胞的生成來介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。在自身免疫性疾病中Treg細胞具有保護性作用,Th17細胞則通過誘導(dǎo)各種促炎因子反而加重疾病。而Siglec-9可通過誘導(dǎo)Treg細胞的形成,抑制Th17細胞,進而改善自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng),減輕關(guān)節(jié)軟骨和骨的損傷[15]。
2.1 Siglec-9對腫瘤增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響MUC1粘蛋白簡稱MUC1,是1型跨膜糖蛋白,其蛋白結(jié)構(gòu)域高度O-糖基化,以絲氨酸和蘇氨酸殘基為特征[16]。MUC1在正常上皮細胞中廣泛存在,并起保護作用,而在乳腺癌、胰腺癌等大多數(shù)腺癌中MUC1的O-糖鏈會發(fā)生異常糖基化改變,O-糖鏈由長支鏈變成多個唾液酸化短鏈, 研究發(fā)現(xiàn)唾液酸化短鏈的形成與癌組織內(nèi)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶增加有關(guān),在α-2,3唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和α-6唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的作用下,Tn糖抗原和T糖抗原會發(fā)生唾液酸化,形成STn和ST。其中STn的高表達可促進腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移能力,是低分化腺癌和粘液癌的標(biāo)志,而ST可與免疫抑制受體Siglec-9結(jié)合[17-18]。與其他Siglec-9配體不同的是,MUC1-ST并未促進ITIM基序的磷酸化,而是通過誘導(dǎo)鈣通量激活MEK-ERK信號通路,促進與腫瘤相關(guān)因子的分泌,如與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管形成相關(guān)的PAI-1[17,19]。除分泌因子外,Siglec-9與MUC1結(jié)合還觸發(fā)對β-catenin的募集,隨后β-catenin通過MUC1從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核[20]。β-catenin作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,可增加細胞周期相關(guān)基因Cyclin D1和c-Myc的表達,導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖以及新生血管的形成,進一步促進腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[21-22]。此外,Siglec-9與MUC1結(jié)合還可抑制gsk-3β對β-catenin的磷酸化,從而可能維持β-catenin的穩(wěn)定,進而促進惡性表型的形成[20]。但是有趣的是,另有文獻報道,Siglec-9的可溶性形式(sSiglec-9)可通過競爭性抑制MUC1與Siglec-9的結(jié)合,進一步避免負(fù)向免疫調(diào)節(jié)和/或抑制腫瘤相關(guān)的MUC1下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及隨后的腫瘤增殖,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。除了上述MUC1之外,還發(fā)現(xiàn)Siglec-9可與卵巢癌高表達的MUC16結(jié)合,作為粘附分子,MUC16還可能促進卵巢癌的腹膜轉(zhuǎn)移[24]。
2.2Siglec-9對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)MUC1與巨噬細胞上的Siglec-9結(jié)合,可促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAMs)的形成,TAMs能夠抑制CD8+T細胞的增殖,過表達IL-10以抑制樹突狀細胞分泌IL-12。此外,TAMs還可誘導(dǎo)FoxP3 Treg細胞的形成進一步參與對腫瘤免疫的負(fù)調(diào)控。免疫抑制分子IDO、PD-L1也表達上調(diào),不僅抑制T細胞的活化和增殖,還促進T細胞凋亡,為腫瘤的發(fā)展?fàn)I造有利的微環(huán)境[17,25-26]。其次,Siglec-9還高表達于NK細胞表面,作為細胞表面抑制性受體可與腫瘤表面的唾液酸碳水化合物結(jié)合,抑制NK細胞的激活和對腫瘤的殺傷活性[27]。除負(fù)調(diào)控NK對腫瘤細胞的殺傷活性外,Jandus等[27]還發(fā)現(xiàn)相比Siglec-9-NK細胞,Siglec-9+NK細胞高表達趨化因子受體CXCR1和CX3CR1,對IL-8的趨化傾向更為顯著。而IL-8對腫瘤的增殖、侵襲以及新生血管的形成具有促進作用[28]。
Siglec-9在外周血T細胞上的表達很少,但在非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌患者腫瘤浸潤性T細胞上的表達顯著增加,與腫瘤細胞表面唾液聚糖結(jié)合可抑制TIL的激活,與患者的存活率成負(fù)相關(guān)[29]。在黑色素瘤中也存有相似情況,Siglec-9可抑制記憶性CD8+T細胞的TCR信號傳導(dǎo),降低細胞毒性并下調(diào)IFN-γ和TNF-α等細胞因子的表達[30]。
綜上,有理由認(rèn)為Siglec-9的表達對腫瘤的免疫微環(huán)境具有負(fù)調(diào)控作用,進而促進腫瘤的發(fā)展。
2.3Siglec-9對免疫監(jiān)視的調(diào)控Siglec-9作為免疫細胞膜表面的抑制性受體,與惡變細胞膜表面的唾液酸殘基結(jié)合,不僅能夠直接抑制免疫細胞的毒性,如NK細胞以及CD8+T細胞等,還促進免疫抑制分子的表達,削弱體內(nèi)免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能。而且對于糖基化程度很高的MUC,Siglec-9還可誘導(dǎo)腫瘤細胞的生長[20,27,29-30]。未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells,iDCs)具有很強的抗原吞噬能力,而相比成熟DCs來說,iDCs中Siglec-9的表達明顯上調(diào),與癌細胞表面的唾液酸殘基結(jié)合會導(dǎo)致IL-12的表達降低,抑制Th1細胞的免疫應(yīng)答以及IFN-γ、TNF-α等因子分泌[31-32]。這些結(jié)果表明,Siglec-9對腫瘤免疫微環(huán)境的改變促使腫瘤逃避免疫監(jiān)視,而對腫瘤細胞的促生長作用則又進一步使得腫瘤發(fā)生免疫逃逸。
此外,Siglec-9還可誘導(dǎo)癌細胞中的鈣蛋白酶激活來促進粘著斑激酶以及一些信號蛋白如Akt9、paxillin等發(fā)生降解,從而調(diào)節(jié)癌細胞的粘附動力學(xué),提高癌細胞的遷移和侵襲特性,增加癌細胞的活力和存活率。所以,這可能是癌細胞逃避免疫監(jiān)視的另一種途徑和機制[33]。
3.1 Siglec-9單抗與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合治療近年來,隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的興起,免疫檢查點抑制劑已逐步成為當(dāng)前比較熱門的一種癌癥治療方法。與單純化療相比,PD-1或PD-L1單抗可顯著延長肺癌患者的生存期[34]。然而,絕大多數(shù)患者常由于耐藥性的產(chǎn)生而導(dǎo)致療效不佳[35]。因此針對單一免疫檢查點抑制劑治療的弊端,有學(xué)者提出聯(lián)合治療的策略。聯(lián)合療法是提高患者免疫應(yīng)答率和預(yù)后的一種良策[36]。研究表明,靶向Siglec-9/唾液酸可提高抗腫瘤免疫力,故可將該通路作為T細胞激活用于免疫治療的潛在靶點。由于CD8+TIL上除Siglec-9的表達外,還包括PD-1、TIM-3、LAG3等幾種抑制性受體共表達,故可考慮將抗Siglec-9單價抗體與抗PD-1抗體等多種免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用,有望提高臨床腫瘤患者的緩解率和預(yù)后[29,37]。
3.2抗體藥物偶聯(lián)物的治療有研究發(fā)現(xiàn)將重組唾液酸酶與人表皮生長因子受體2 (human epithelial growth factor receptor-2,HER2)特異性抗體曲妥珠單抗偶聯(lián),可增強對乳腺癌細胞的殺傷。在幾個HER2+乳腺癌細胞系中,觀察到曲妥珠單抗-唾液酸酶偶聯(lián)物可成功去除癌細胞表面Siglec-7和Siglec-9的配體,減少自然殺傷NK細胞與腫瘤表面配體相結(jié)合,并增強NKG2D的結(jié)合[38]。NKG2D是固有免疫系統(tǒng)中一個重要的激活性受體,它能識別靶細胞表面配體來傳遞活化信號,激活免疫系統(tǒng),從而對靶細胞發(fā)揮殺傷作用。與單用曲妥珠抗體相比,抗體-唾液酸酶復(fù)合物增強了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷,通過阻止抑制性Siglec受體/配體相互作用和刺激ADCC進一步增強其細胞毒作用[38]。因此,將曲妥珠單抗與唾液酸酶聯(lián)合應(yīng)用是一很有前景的癌癥免疫治療方法。
3.3基于聚糖抑制劑的治療由于醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展,納米材料在腫瘤生物診斷和治療方面已有相關(guān)應(yīng)用。利用納米粒子向黑色素瘤細胞靶向遞送唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑3Fax-Peracyl Neu5Ac,不僅降低腫瘤細胞表面的唾液酸化,增加免疫細胞向腫瘤的浸潤,還可大大提高靶向釋藥的劑量和精準(zhǔn)度以及降低腎毒性等毒副反應(yīng)[39]。此外,Büll等[40]發(fā)現(xiàn)向小鼠瘤體內(nèi)注射唾液聚糖生物合成抑制劑Ac53FaxNeu5Ac,不僅可阻斷黑色素瘤以及神經(jīng)母細胞瘤中唾液聚糖的表達,還可增加腫瘤微環(huán)境中NK細胞和CD8+T細胞的數(shù)量,增強CD8+T細胞的細胞毒性,并且降低Treg細胞和MDSC細胞的生成,從而抑制腫瘤的生長。
3.4Siglec-9在影像學(xué)方面的應(yīng)用除腫瘤靶向免疫治療外,Siglec-9還可用于臨床影像學(xué)診斷。正常狀況下血管粘附蛋白-1儲存于內(nèi)皮細胞顆粒中,一旦出現(xiàn)炎癥,會迅速轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細胞表面,可與Siglec-9發(fā)生特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn),這一特性可用于炎癥和腫瘤的PET成像[41]。68Ga-DOTA-Siglec-9是通過螯合劑DOTA結(jié)合68Ga對Siglec-9肽(由Siglec-9中的 283-297殘基組成,此處以Siglec-9肽統(tǒng)稱)進行標(biāo)記獲得的,它是由二硫鍵橋聯(lián)的小分子環(huán)肽,可用于早期滑膜炎的診斷[42]。此外,還可用于動脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合癥以及伯氏桿菌感染所致的關(guān)節(jié)炎檢測等[43-45]。之前常用的[18F]FDG PET成像主要是依賴炎癥細胞的糖酵解活性,缺乏特異性,易造成假陽性,但18F在空間分辨率上要優(yōu)于68Ga,故有研究者設(shè)計出[18F]AlF-NOTA-Siglec-9這一替代性放射示蹤劑,試驗發(fā)現(xiàn)其在空間分辨率和放化程度以及摩爾活度上皆具有較好表現(xiàn)[46]。
Siglec-9是免疫細胞膜表面的抑制性唾液酸受體,可負(fù)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境促進腫瘤的免疫逃逸,并且誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及新生血管形成,進一步促進腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。目前已逐步開展針對Siglec-9這一靶點的腫瘤靶向免疫治療,如聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑以及將唾液酸酶與其他抗體偶聯(lián)等治療手段。未來還可將針對唾液酸/Siglec-9通路的單克隆抗體與化療藥物、生物毒素相結(jié)合制備“生物導(dǎo)彈”定向殺滅癌細胞,減少腫瘤藥物不良反應(yīng);還可輔以放療,進一步加大對癌細胞的殺傷。并且還可制備出雙特異性抗體,分別針對免疫細胞如NK細胞或T細胞表面的Siglec-9和腫瘤細胞表面抗原,這樣能夠大大增強NK細胞和T細胞的細胞毒性,提高療效。此外,通過基因敲除的方法,定向敲除與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的免疫細胞Siglec-9的表達,進而發(fā)揮抗腫瘤作用,還有待于進一步探索研究。