Siglec-9對腫瘤發(fā)展的影響及在腫瘤靶向治療和影像診斷中的應(yīng)用

彭 燕，唐 奇綜述，馮振卿審校

0 引 言

Siglec-9是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，Siglec)家族的成員之一，通常表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、CD56+NK細(xì)胞，以及少量正常T細(xì)胞膜表面。Siglec-9通過識別含有唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞之間或細(xì)胞與病原體之間的相互作用，對機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫具有抑制作用。越來越多的證據(jù)表明，Siglec-9在腫瘤發(fā)展中具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Siglec-9不僅可促進(jìn)腫瘤的增殖侵襲轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成，還可負(fù)調(diào)控免疫微環(huán)境。這些發(fā)現(xiàn)給腫瘤治療提供了一個新的靶點，近年來已逐步開展針對Siglec-9的腫瘤免疫治療。本文將對Siglec-9的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能以及在腫瘤靶向治療和影像診斷中的作用作一綜述。

1 Siglec-9的基本結(jié)構(gòu)與功能

1.1 Siglec-9的基本結(jié)構(gòu)Siglecs按序列保守程度可分為兩大類：一類是序列可變的CD33相關(guān)性Siglecs，另一類是序列保守的經(jīng)典型Siglecs。人源Siglecs有15種，CD33相關(guān)性Siglecs包含有Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-9等11種，經(jīng)典型Siglecs分別是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-4以及Siglec-15等4種。鼠源Siglecs有9種，其中CD33相關(guān)性Siglecs包括Siglec-3，Siglec-E、Siglec-F、Siglec-G以及Siglec-H，經(jīng)典型Siglecs同人源的4種類型一樣，并且Siglec-E與人源性Siglec-9屬于同源物，常用Siglec-E替代研究Siglec-9的功能[1]。

Siglec-9基因位于人19號染色體，由七個外顯子和六個內(nèi)含子組成，編碼區(qū)含有1392個核苷酸。Siglec-9是Siglec-9基因編碼的單次I型跨膜蛋白，含463個氨基酸，分子量大小為50 Kda左右，特異性表達(dá)于髓系細(xì)胞和免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜表面[2-3]。Siglec-9胞外區(qū)包含3個Ig樣結(jié)構(gòu)域，分別是1個V-set Ig樣結(jié)構(gòu)域和2個C2-set樣結(jié)構(gòu)域[2]。其中V-set結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R別唾液酸具有重要作用，它包含兩個對識別唾液酸有重要影響的氨基酸殘基，分別是β鏈中的精氨酸和色氨酸，這些殘基可分別與唾液酸的羧基和甘油狀側(cè)鏈直接相互作用[4]。胞質(zhì)區(qū)內(nèi)有兩個保守的含酪氨酸的基序，分別是基于酪氨酸的免疫受體抑制基序(immune receptor tyrosine - based inhibitory motif, ITIMs)和SLAM樣基序。其中ITIM與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，磷酸化后可招募酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫。此外，膜近端基序的突變還可增加Siglec-9的唾液酸結(jié)合活性[5]。

1.2Siglec-9的生物學(xué)功能中性粒細(xì)胞上Siglec-9的表達(dá)較高，作為抑制性唾液酸受體，可調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞死亡。研究表明Siglec-9可對磷脂酰絲氨酸再分配并加速DNA的裂解，其表達(dá)與中性粒細(xì)胞的自發(fā)性凋亡呈正相關(guān)。且在促炎因子GM-CSF、IFN-S、IFN-γ的作用下，Siglec-9還可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的自噬性死亡，細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)空泡化，線粒體腫脹等改變[6-7]。

Siglec-E和Siglec-9是不同種屬間結(jié)構(gòu)相似，功能相同的直系同源物，主要表達(dá)于小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面。當(dāng)中性粒細(xì)胞上的β整合素與纖維蛋白原或其他β整合素配體連接后，Siglec-E會與β整合素配體上的唾液酸以唾液酸依賴的方式相結(jié)合，與配體結(jié)合后的Siglec-E可能對β整合素下游信號通路產(chǎn)生影響，如抑制Syr Tyr317的磷酸化和p38 MAPK的激活以及激活β整合素觸發(fā)的Akt和產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，從而正向調(diào)節(jié)還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性和ROS的產(chǎn)生[8]。ROS作為抗炎因子可抑制中性粒細(xì)胞的遷移和募集，保護(hù)炎癥組織免受中性粒細(xì)胞過度募集造成的損傷，故而Siglec-9表達(dá)水平的增加對于如慢性阻塞性肺疾病、慢性鼻炎等炎癥的控制具有積極作用[9-10]。此外，Siglec-E還參與脂多糖刺激引起的TLR4反應(yīng)負(fù)調(diào)控以及大腸桿菌誘導(dǎo)的TLR4內(nèi)吞[11]。

TCR是T細(xì)胞表面受體，通過識別特異性抗原肽，引起下游信號通路的活化。Siglec-9僅在少數(shù)T細(xì)胞亞群中表達(dá)，與Siglec-9配體結(jié)合后，會對TCR信號產(chǎn)生負(fù)調(diào)控。在TCR受到刺激后可增強(qiáng)Siglec-9的酪氨酸磷酸化以及ITIM基序?qū)HP-1的招募，降低ZAP70上319位酪氨酸的磷酸化，從而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少和活化T細(xì)胞核因子轉(zhuǎn)錄活性降低，抑制T細(xì)胞的活化[12]。Siglec-9除了促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和活化外，還可通過ITIMs基序促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子IL-10，減少促炎因子的生成[13]。

Siglec-9還可調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞的生成來介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。在自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞具有保護(hù)性作用，Th17細(xì)胞則通過誘導(dǎo)各種促炎因子反而加重疾病。而Siglec-9可通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的形成，抑制Th17細(xì)胞，進(jìn)而改善自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，減輕關(guān)節(jié)軟骨和骨的損傷[15]。

2 Siglec-9對腫瘤生物學(xué)特性的影響

2.1 Siglec-9對腫瘤增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響MUC1粘蛋白簡稱MUC1,是1型跨膜糖蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)域高度O-糖基化，以絲氨酸和蘇氨酸殘基為特征[16]。MUC1在正常上皮細(xì)胞中廣泛存在，并起保護(hù)作用，而在乳腺癌、胰腺癌等大多數(shù)腺癌中MUC1的O-糖鏈會發(fā)生異常糖基化改變，O-糖鏈由長支鏈變成多個唾液酸化短鏈, 研究發(fā)現(xiàn)唾液酸化短鏈的形成與癌組織內(nèi)唾液酸基轉(zhuǎn)移酶增加有關(guān)，在α-2,3唾液酸基轉(zhuǎn)移酶和α-6唾液酸基轉(zhuǎn)移酶的作用下，Tn糖抗原和T糖抗原會發(fā)生唾液酸化，形成STn和ST。其中STn的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移能力，是低分化腺癌和粘液癌的標(biāo)志，而ST可與免疫抑制受體Siglec-9結(jié)合[17-18]。與其他Siglec-9配體不同的是，MUC1-ST并未促進(jìn)ITIM基序的磷酸化，而是通過誘導(dǎo)鈣通量激活MEK-ERK信號通路，促進(jìn)與腫瘤相關(guān)因子的分泌，如與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管形成相關(guān)的PAI-1[17,19]。除分泌因子外，Siglec-9與MUC1結(jié)合還觸發(fā)對β-catenin的募集，隨后β-catenin通過MUC1從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核[20]。β-catenin作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，可增加細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖以及新生血管的形成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[21-22]。此外，Siglec-9與MUC1結(jié)合還可抑制gsk-3β對β-catenin的磷酸化，從而可能維持β-catenin的穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)惡性表型的形成[20]。但是有趣的是，另有文獻(xiàn)報道，Siglec-9的可溶性形式(sSiglec-9)可通過競爭性抑制MUC1與Siglec-9的結(jié)合,進(jìn)一步避免負(fù)向免疫調(diào)節(jié)和/或抑制腫瘤相關(guān)的MUC1下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及隨后的腫瘤增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。除了上述MUC1之外，還發(fā)現(xiàn)Siglec-9可與卵巢癌高表達(dá)的MUC16結(jié)合，作為粘附分子，MUC16還可能促進(jìn)卵巢癌的腹膜轉(zhuǎn)移[24]。

2.2Siglec-9對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)MUC1與巨噬細(xì)胞上的Siglec-9結(jié)合，可促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAMs)的形成，TAMs能夠抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，過表達(dá)IL-10以抑制樹突狀細(xì)胞分泌IL-12。此外，TAMs還可誘導(dǎo)FoxP3 Treg細(xì)胞的形成進(jìn)一步參與對腫瘤免疫的負(fù)調(diào)控。免疫抑制分子IDO、PD-L1也表達(dá)上調(diào)，不僅抑制T細(xì)胞的活化和增殖，還促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，為腫瘤的發(fā)展?fàn)I造有利的微環(huán)境[17,25-26]。其次，Siglec-9還高表達(dá)于NK細(xì)胞表面，作為細(xì)胞表面抑制性受體可與腫瘤表面的唾液酸碳水化合物結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的激活和對腫瘤的殺傷活性[27]。除負(fù)調(diào)控NK對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性外，Jandus等[27]還發(fā)現(xiàn)相比Siglec-9-NK細(xì)胞，Siglec-9+NK細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CXCR1和CX3CR1,對IL-8的趨化傾向更為顯著。而IL-8對腫瘤的增殖、侵襲以及新生血管的形成具有促進(jìn)作用[28]。

Siglec-9在外周血T細(xì)胞上的表達(dá)很少，但在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌患者腫瘤浸潤性T細(xì)胞上的表達(dá)顯著增加，與腫瘤細(xì)胞表面唾液聚糖結(jié)合可抑制TIL的激活，與患者的存活率成負(fù)相關(guān)[29]。在黑色素瘤中也存有相似情況，Siglec-9可抑制記憶性CD8+T細(xì)胞的TCR信號傳導(dǎo)，降低細(xì)胞毒性并下調(diào)IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)[30]。

綜上，有理由認(rèn)為Siglec-9的表達(dá)對腫瘤的免疫微環(huán)境具有負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

2.3Siglec-9對免疫監(jiān)視的調(diào)控Siglec-9作為免疫細(xì)胞膜表面的抑制性受體，與惡變細(xì)胞膜表面的唾液酸殘基結(jié)合，不僅能夠直接抑制免疫細(xì)胞的毒性，如NK細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞等，還促進(jìn)免疫抑制分子的表達(dá)，削弱體內(nèi)免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能。而且對于糖基化程度很高的MUC，Siglec-9還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長[20,27,29-30]。未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells,iDCs)具有很強(qiáng)的抗原吞噬能力，而相比成熟DCs來說，iDCs中Siglec-9的表達(dá)明顯上調(diào)，與癌細(xì)胞表面的唾液酸殘基結(jié)合會導(dǎo)致IL-12的表達(dá)降低，抑制Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答以及IFN-γ、TNF-α等因子分泌[31-32]。這些結(jié)果表明，Siglec-9對腫瘤免疫微環(huán)境的改變促使腫瘤逃避免疫監(jiān)視，而對腫瘤細(xì)胞的促生長作用則又進(jìn)一步使得腫瘤發(fā)生免疫逃逸。

此外，Siglec-9還可誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的鈣蛋白酶激活來促進(jìn)粘著斑激酶以及一些信號蛋白如Akt9、paxillin等發(fā)生降解，從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的粘附動力學(xué)，提高癌細(xì)胞的遷移和侵襲特性，增加癌細(xì)胞的活力和存活率。所以，這可能是癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的另一種途徑和機(jī)制[33]。

3 Siglec-9在腫瘤靶向治療和影像診斷中的作用

3.1 Siglec-9單抗與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合治療近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的興起，免疫檢查點抑制劑已逐步成為當(dāng)前比較熱門的一種癌癥治療方法。與單純化療相比，PD-1或PD-L1單抗可顯著延長肺癌患者的生存期[34]。然而，絕大多數(shù)患者常由于耐藥性的產(chǎn)生而導(dǎo)致療效不佳[35]。因此針對單一免疫檢查點抑制劑治療的弊端，有學(xué)者提出聯(lián)合治療的策略。聯(lián)合療法是提高患者免疫應(yīng)答率和預(yù)后的一種良策[36]。研究表明，靶向Siglec-9/唾液酸可提高抗腫瘤免疫力，故可將該通路作為T細(xì)胞激活用于免疫治療的潛在靶點。由于CD8+TIL上除Siglec-9的表達(dá)外，還包括PD-1、TIM-3、LAG3等幾種抑制性受體共表達(dá)，故可考慮將抗Siglec-9單價抗體與抗PD-1抗體等多種免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，有望提高臨床腫瘤患者的緩解率和預(yù)后[29,37]。

3.2抗體藥物偶聯(lián)物的治療有研究發(fā)現(xiàn)將重組唾液酸酶與人表皮生長因子受體2 (human epithelial growth factor receptor-2,HER2)特異性抗體曲妥珠單抗偶聯(lián)，可增強(qiáng)對乳腺癌細(xì)胞的殺傷。在幾個HER2+乳腺癌細(xì)胞系中，觀察到曲妥珠單抗-唾液酸酶偶聯(lián)物可成功去除癌細(xì)胞表面Siglec-7和Siglec-9的配體，減少自然殺傷NK細(xì)胞與腫瘤表面配體相結(jié)合，并增強(qiáng)NKG2D的結(jié)合[38]。NKG2D是固有免疫系統(tǒng)中一個重要的激活性受體,它能識別靶細(xì)胞表面配體來傳遞活化信號，激活免疫系統(tǒng)，從而對靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。與單用曲妥珠抗體相比，抗體-唾液酸酶復(fù)合物增強(qiáng)了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷，通過阻止抑制性Siglec受體/配體相互作用和刺激ADCC進(jìn)一步增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用[38]。因此，將曲妥珠單抗與唾液酸酶聯(lián)合應(yīng)用是一很有前景的癌癥免疫治療方法。

3.3基于聚糖抑制劑的治療由于醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料在腫瘤生物診斷和治療方面已有相關(guān)應(yīng)用。利用納米粒子向黑色素瘤細(xì)胞靶向遞送唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑3Fax-Peracyl Neu5Ac，不僅降低腫瘤細(xì)胞表面的唾液酸化，增加免疫細(xì)胞向腫瘤的浸潤，還可大大提高靶向釋藥的劑量和精準(zhǔn)度以及降低腎毒性等毒副反應(yīng)[39]。此外，Büll等[40]發(fā)現(xiàn)向小鼠瘤體內(nèi)注射唾液聚糖生物合成抑制劑Ac53FaxNeu5Ac，不僅可阻斷黑色素瘤以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤中唾液聚糖的表達(dá)，還可增加腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且降低Treg細(xì)胞和MDSC細(xì)胞的生成，從而抑制腫瘤的生長。

3.4Siglec-9在影像學(xué)方面的應(yīng)用除腫瘤靶向免疫治療外，Siglec-9還可用于臨床影像學(xué)診斷。正常狀況下血管粘附蛋白-1儲存于內(nèi)皮細(xì)胞顆粒中，一旦出現(xiàn)炎癥，會迅速轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞表面，可與Siglec-9發(fā)生特異性結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，這一特性可用于炎癥和腫瘤的PET成像[41]。68Ga-DOTA-Siglec-9是通過螯合劑DOTA結(jié)合68Ga對Siglec-9肽(由Siglec-9中的 283-297殘基組成，此處以Siglec-9肽統(tǒng)稱)進(jìn)行標(biāo)記獲得的，它是由二硫鍵橋聯(lián)的小分子環(huán)肽，可用于早期滑膜炎的診斷[42]。此外，還可用于動脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合癥以及伯氏桿菌感染所致的關(guān)節(jié)炎檢測等[43-45]。之前常用的[18F]FDG PET成像主要是依賴炎癥細(xì)胞的糖酵解活性，缺乏特異性，易造成假陽性，但18F在空間分辨率上要優(yōu)于68Ga，故有研究者設(shè)計出[18F]AlF-NOTA-Siglec-9這一替代性放射示蹤劑，試驗發(fā)現(xiàn)其在空間分辨率和放化程度以及摩爾活度上皆具有較好表現(xiàn)[46]。

4 結(jié)語與展望

Siglec-9是免疫細(xì)胞膜表面的抑制性唾液酸受體，可負(fù)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及新生血管形成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。目前已逐步開展針對Siglec-9這一靶點的腫瘤靶向免疫治療，如聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑以及將唾液酸酶與其他抗體偶聯(lián)等治療手段。未來還可將針對唾液酸/Siglec-9通路的單克隆抗體與化療藥物、生物毒素相結(jié)合制備“生物導(dǎo)彈”定向殺滅癌細(xì)胞，減少腫瘤藥物不良反應(yīng)；還可輔以放療，進(jìn)一步加大對癌細(xì)胞的殺傷。并且還可制備出雙特異性抗體，分別針對免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞或T細(xì)胞表面的Siglec-9和腫瘤細(xì)胞表面抗原，這樣能夠大大增強(qiáng)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，提高療效。此外，通過基因敲除的方法，定向敲除與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的免疫細(xì)胞Siglec-9的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，還有待于進(jìn)一步探索研究。