慢性腎病的TGF-β1/Smads信號通路調(diào)控及抗纖維化治療研究進展

李玉琴綜述，游金輝審校

0 引 言

近年來慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)的全球發(fā)病率和死亡率均有明顯提升，已經(jīng)成為威脅人類生命健康的全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。2012年國內(nèi)首個橫斷面流行病學調(diào)查顯示我國CKD的患病率高達10.8%，成為全球CKD高發(fā)國家之一[3]；2015 年我國因CKD住院的人數(shù)占全國總住院人數(shù)的 4.8%[4]。腎纖維化是CKD進展成為終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的最終共同途徑，由不同媒介物通過多種機制和通路介導，包括生長因子，細胞因子，代謝毒素、脂質紊亂和應激分子等[5-7]。研究證實轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是介導腎進行性纖維化并最終發(fā)生、發(fā)展成為ESRD的中樞介質，在CKD中起著致病作用[8-10]。有研究表明TGF-β1可以作為治療靶點以預防腎纖維化的發(fā)生和進展，但TGF-β1除了誘導組織纖維化外還調(diào)節(jié)許多生物反應，包括細胞增殖、凋亡、分化、自噬和免疫反應等，尤其是TGF-β1作為免疫應答的負調(diào)節(jié)因子的中心作用致使在CKD的臨床治療靶點研究中進展非常緩慢和謹慎[11-12]。本文就近年來TGF-β/Smad信號傳導通路在CKD腎纖維化發(fā)病機制中 的調(diào)控以及抗腎纖維化靶向治療方面的研究進展作簡要綜述，以期提高CKD的診治效率。

1 TGF-β及其在腎纖維化中的調(diào)控

1.1 TGF-β的生物學特性TGF-β家族蛋白是一種在結構及功能上相互關聯(lián)的多功能介質，廣泛參與調(diào)節(jié)多種生物學過程，包括細胞增殖、分化、自噬、黏附、遷移及凋亡等[12]。TGF-β家族主要包括TGF-βs，激活素/抑制素，生長因子，分化因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)和繆勒氏管抑制素(mullerian inhibitor substance，MIS)等[13]。TGF-βs在哺乳動物主要有3種同工型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者在氨基酸水平上有70%～82%的同源性。其中TGF-β1所占比例最高，主要在內(nèi)皮、造血和結締組織細胞中表達，在腎表達最多，能夠被腎各種固有細胞合成[10, 12]。生理條件下，TGF-β1在腎纖維化和炎癥中起保護作用[9]；病理條件下，TGF-β1的過量釋放導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的異常沉積，或誘導足細胞和腎小管上皮細胞的凋亡并逐漸取代正常組織，最終造成組織器官功能障礙。

1.2TGF-β1在腎纖維化中的作用TGF-β1是腎纖維化的主要驅動因素，是一種動態(tài)的病理過程，涉及腎小管細胞損傷或細胞凋亡，炎細胞浸潤，腎間質成纖維細胞活化和過量的ECM沉積導致腎功能受損，最終進展成為ESRD[14]。研究表明TGF-β1的上調(diào)會降低ECM降解蛋白酶活性并上調(diào)蛋白酶抑制因子進而導致過量的ECM產(chǎn)生；使用核心蛋白聚糖、TGF-β1中和抗體、反義寡核苷酸、TGF-β1抑制因子或使其受體基因表達缺失，可以減緩腎纖維化[10, 13, 15]。TGF-β1可通過對各種細胞類型的直接或間接作用促進腎纖維化，主要包括以下幾種病理機制：①最為廣泛的機制是TGF-β1對腎中成纖維細胞型細胞(即系膜細胞和成纖維細胞)的直接作用，誘導其增殖、遷移、激活以及包括膠原蛋白、纖連蛋白和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)等纖維化分子的轉錄[10]；②TGF-β1通過Smad3依賴或非依賴機制直接誘導ECM的產(chǎn)生；③TGF-β1通過間接機制誘導內(nèi)皮細胞和足細胞的凋亡，并可以促進腎小球和腎纖維化[16]；④TGF-β1是間充質基因表達程序的有效誘導劑，誘導上皮細胞、內(nèi)皮細胞、系膜細胞、周細胞等腎固有細胞轉化為肌成纖維細胞。

1.3Samd家族蛋白在腎纖維化中的調(diào)控Samd家族蛋白是TGF-β1最關鍵的下游調(diào)節(jié)因子，不同的 Smads(如Smad2、Smad3 和 Smad4)在調(diào)節(jié)纖維化時卻具有獨特甚至相反的作用。Samds蛋白在纖維化調(diào)節(jié)中的作用極其復雜，具有競爭性的促纖維化和抗纖維化作用，以及與其它信號通路之間的相互作用。 Samd蛋白根據(jù)其結構和功能不同分為3類，即受體激活型Samd蛋白(R-Smads，包括Samd1、Samd2、Samd3、Samd5、Samd8)、共同通路型Samd蛋白(Co-Smads，包括Samd4)和抑制型Samd蛋白(I-Smads，包括Samd6、Samd7)。受體激活型和共同通路型Samd蛋白是正向調(diào)控分子，抑制型Samd蛋白是負向調(diào)控分子。

2 腎纖維化中Smads家族蛋白的作用

2.1 Smad2和Smad3在腎纖維化中的調(diào)控研究證實Smad2、Smad3是TGF-β1發(fā)揮生物學效應的兩個主要介質，Smad3發(fā)揮促纖維化作用，Smad2發(fā)揮腎保護作用[9, 13, 17]。在人類和不同病因的動物模型CKD中Smad2和Smad3均被強烈激活，包括原發(fā)性高血壓腎病、殘余腎病、梗阻性腎病，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)、藥物相關性腎損害、慢性腎移植損傷等[18-20]。有研究表明通過下調(diào)TGF-β1表達、抑制Smad2/3磷酸化和上調(diào)Smad7表達等方法可降低免疫復合物沉積，恢復足細胞損傷，并防止腎小管-間質纖維化。Smad2的條件性缺失可降低Smad3、TGF-β1和肌成纖維細胞標志物表達水平，顯著減輕DN小鼠的腎纖維化及腎小管上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[20]。但另有研究報道，Smad2條件性缺失可通過促進TGF-β1/Smad3信號傳導和增強TGF-β1的自身誘導而促進腎纖維化[21]。

2.2Smad4在調(diào)節(jié)腎纖維化中的調(diào)控Smad4是TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信號通路的共同組成部分，分別促進Smad2/3和Smad1/5/8復合物對TGF-β和BMP的反應[22]。Smad4是將R-Smads和BMP-Smads穿梭至細胞核并調(diào)節(jié)TGF-β誘導膠原蛋白1α1(collagen type 1 α 1，Col1α1)表達的關鍵調(diào)節(jié)因子，但Smad4調(diào)節(jié)Smad3活性可能以啟動其靶基因表達的轉錄更重要，而不是核穿梭。一些研究表明[23-25]，Smad3結合位點位于Col1α2、Col2α1、Col3α1、Col5α1、Col6α1、Col6α3和TIMP-1的啟動子區(qū)域，Smad4的破壞可以阻斷Smad3與膠原蛋白啟動子的結合，從而抑制腎纖維化進程；但是，Smad4破壞導致Smad7表達喪失并抑制Smad7啟動子活性，進而加速核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)介導的腎炎癥[23-25]?？傊?，Smad4是TGF-β1介導腎纖維化和炎癥的關鍵介質，通過與Smad3和Smad7相互作用調(diào)節(jié)兩者在腎炎癥和纖維化中的轉錄活性，因此Smad4不能成為CKD 的治療靶標。

2.3Smad7在調(diào)節(jié)腎纖維化中的調(diào)控Smad7是 TGF-β/Smad 信號傳導通路的負反饋抑制劑，通過抑制Smad2/Smad3磷酸化和促進活化的I型受體降解來阻斷TGF-β1信號傳導[26]。有研究表明，Smad7通過基于質粒的基因轉移過度表達可以抑制腎纖維化并減少NF-κB驅動的炎癥[9]。在高血壓腎病動物模型中，Smad7過表達通過抑制血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)誘導的TGF-β/ Smad3和NF-κB途徑以及靶向Smad3依賴性microRNA-21，可抑制腎纖維化和炎癥反應，進而改善預后[18]。由此可推斷出，通過下調(diào)Smad3活性同時上調(diào)Smad7活性來恢復二者之間的平衡，可能是治療CKD腎纖維化的一個有效策略。

3 TGF-β/Smads信號通路依賴性微小核糖核酸(miRNAs)及長鏈非編碼核糖核酸(IncRNAs)在腎纖維化中的調(diào)控

近年來，有研究表明miRNAs及IncRNAs在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TGF-β1通過上調(diào)miRNA-21、192、377、382和491-5，下調(diào)miRNA-455-3p、29、378和let-7可以促進腎纖維化[27-30]。有研究顯示與健康供體腎活檢組織相比，CKD患者腎組織中有116種miRNAs通常失調(diào)，其中包括40種上調(diào)和76種下調(diào)；此外，該研究也顯示上調(diào)hsa-miR-3607-3p和下調(diào)hsa-miR-4709-3p可能代表抗腎纖維化的有希望的治療靶點[31]。另一項研究顯示miR-133b和miR-199b在DN大鼠腎皮質和TGF-β1處理的人近端小管細胞中高度表達；此外，SIRT1被鑒定為HK-2細胞中miR-133b和miR-199b的靶標，通過上調(diào)SIRT1可抑制miR-133b和miR-199b表達水平進而減弱TGF-β1誘導的EMT和腎纖維化[32]。有證據(jù)表明，IncRNAs通過直接致病作用或作為某些腎病通路的間接介質，如TGF-β1、NF-κB、STAT3和GSK-3β等信號傳導，參與DN的發(fā)生和發(fā)展[30]。不同的IncRNAs可以通過相同的信號傳導機制發(fā)揮類似的細胞效應。例如，PVT1、TUG1、RP23、MGC和ASncmtRNA 2通過靶向調(diào)節(jié)TGF-β1通路而促進DN中的ECM過量沉積[30]?？傊?，TGF-β/Smads信號通路介導的miRNAs、IncRNAs在腎纖維化的調(diào)控機制可能是一種有前途的治療CKD的研究方向。

4 TGF-β/Smad信號傳導通路靶向治療腎纖維化的潛在策略

4.1 阻斷TGF-β1信號傳導鑒于TGF-β1在腎纖維化中的中樞作用，將抗TGF-β1作為治療靶點正被廣泛探討。阻斷TGF-β1信號傳導策略包括TGF-β1中和抗體，反義寡脫氧核苷酸，可溶性人TβRII和TGF-β受體特異性抑制劑(GW788388和IN-1130)等，可預防腎疾病模型中的腎纖維化[33- 34]。曹望森[35]研究報道，在腎小管細胞中TGF-β能夠抑制Klotho蛋白表達，使用TGF-β 受體抑制劑能緩解單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)導致的Klotho表達水平下調(diào)、Klotho 啟動子超甲基化和DNMT1/DNMT3a異常表達，從而抑制腎纖維化。Choi等[36]研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活物-1α (peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1α，PGC-1α)可通過上調(diào)let-7b/c同時下調(diào)TGF-β RI抑制TGF-β/Smad信號通路激活，使其成為治療CKD有吸引力的靶標。長非編碼核糖核酸(TGF-β/Smad3-interacting long noncoding RNA，lnc-TSI)通過與Smad3的MH2結構域結合，特異性抑制TGF-β誘導的Smad3磷酸化和下游纖維化基因表達，將人lnc-TSI導入到UUO小鼠模型中，可抑制腎組織中Smad3的磷酸化并減輕腎纖維化[37]。乙?；?11-酮基-β-乳香酸在UUO小鼠模型中以劑量依賴的方式顯著下調(diào)TGFβ-RI，TGFβ-RII，磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)和Smad4的表達，同時上調(diào)Klotho和Smad7表達，可以顯著抑制腎纖維化[38]。然而，由于廣泛抑制TGF-β信號使其喪失了抗炎和抗腫瘤的能力，致使TGF-β1靶向治療失敗。例如，Voelker等[39]的隨機雙盲II期臨床研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1特異性人源化中和單克隆抗體未能阻止DN的進展。

4.2選擇性抑制Smad信號傳導抑制TGF-β1信號傳導通路的下游靶點已成為研究熱點，如Smad2、Smad3、Smad 4、Smad7和Smad依賴的microRNAs等，可作為預防和治療腎纖維化的潛在策略。有研究表明Smad7可與Smad2、Smad3競爭結合TGF-β RI或Samd4，抑制Smad2/3磷酸化和向細胞核內(nèi)轉移，負向調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號傳導通路，抑制不同腎疾病模型中的腎炎癥和纖維化[9, 13]。Smad3磷?；倪x擇性抑制劑可通過抑制α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、肌成纖維細胞積聚和ECM沉積，顯著抑制DN和UUO進行性腎纖維化，提示靶向治療Smad3可能是一種特異性的有效的腎纖維化治療方法[17]。

4.3天然產(chǎn)物對Smads信號傳導的特異性抑制有研究顯示有些天然產(chǎn)物可以延緩腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展，有望成為抗腎纖維化治療藥物。Zhang等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在腺嘌呤喂養(yǎng)誘發(fā)的CKD小鼠模型中，大黃酸能劑量依賴性地增加Klotho啟動子的基礎活性并抑制TGF-β介導的Klotho啟動子沉默，還能顯著逆轉E-鈣粘蛋白、a-SMA、β-連環(huán)蛋白和p-Smad3的異常表達，提示大黃酸在病理條件下能夠有效抑制Klotho丟失從而發(fā)揮抗腎纖維化作用。鄭小鵬等[41]研究報道，黃芪苷通過下調(diào)TGF-β1的表達從而抑制a-SMA的表達，可改善腎纖維化和延緩DN的進展。在UUO小鼠模型中，茶藨子可下調(diào)TGF-β1、α-SMA、p-Smad2/3、p-ERK1/2、p-p38和p-JNK表達，上調(diào)Smad7表達，提示茶藨子可通過TGF-β/Smad和MAPK途徑改善腎纖維化[42]。靈芝的新型小分子類萜類化合物A(petA)可通過抑制Smad3和NF-κBp 65磷酸化，減少巨噬細胞的浸潤、抑制促炎細胞因子(IL-1β和TNF-α)的表達和減少ECM沉積(α-SMA和Col)來預防腎炎癥和纖維化[43]。另有研究報道，內(nèi)源性白細胞介素-15(endogenous interleukin-15，IL-15)與TGF-β1水平的失衡可使腎更容易發(fā)生EMT，IL-15可能是人類腎中TGF-β的天然抑制劑，能夠保證上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)和預防EMT。此外，外源性IL-15治療可能對某些人類腎病如DN有益[19]。

5 問題與展望

慢性腎病腎纖維化目前尚無特效治療方法，TGF-β1/Smads信號通路調(diào)控及抗腎纖維化治療策略已經(jīng)得到各界廣泛關注。TGF-β1是腎纖維化進程中的關鍵因子，完全阻斷TGF-β1不足以緩解病情并且可能通過加劇腎炎癥而使疾病惡化。為了避免TGF-β1信號通路完全阻滯而引起的副作用，其下游靶點如smad3、Smad7、smad依賴性miRNAs及IncRNAs和天然產(chǎn)物作為抗腎纖維化靶點治療劑已成為研究熱點，但目前大量研究僅局限于基礎試驗和動物模型，真正應用于臨床仍有較遠距離。隨著TGF-β1/Smads信號通路在腎纖維化的發(fā)病機制研究的深入，將會為CKD抗腎纖維化治療提供新的策略與思路。