抗體偶聯(lián)藥物IgG-SMCC-DM1的構(gòu)建及紫外光譜鑒定

林 源，鄭金宇,，馬小虎，楊 林，梁 彤，王 銳,楊延輝

抗體偶聯(lián)藥物(ADC)是通過連接子技術(shù)將具有靶向性的抗體與具有生物活性的藥物相結(jié)合的一種偶聯(lián)物，使藥物獲得了靶向性，從而可以靶向到特定的組織或細(xì)胞后再釋放出藥物發(fā)揮作用[1]。ADC藥物多以針對腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物[2-4]。2000年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了首個(gè)ADC藥物Mylotarg，用于治療急性髓性白血病患者。截至2018年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了4種抗癌抗體偶聯(lián)藥物，分別針對急性粒細(xì)胞白血病、霍奇金淋巴瘤、HER2陽性乳腺癌、急性髓性白血病4種疾病，而全球有超過85個(gè)ADC新藥處于臨床試驗(yàn)的不同階段[5-7]。ADC藥物成功與否取決于靶點(diǎn)、抗體、細(xì)胞毒素、連接物4個(gè)方面。其中，將具有靶向性的抗體與細(xì)胞毒素連接起來的技術(shù)，是構(gòu)建ADC的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞毒素通過連接子可以連接到抗體IgG表面的賴氨酸殘基，或連接到鉸鏈區(qū)二硫鍵還原后形成的半胱氨酸。此外，還可通過在抗體特定位點(diǎn)引入半胱氨酸或非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)[8-10]。偶聯(lián)后的ADC需要檢驗(yàn)其偶聯(lián)效率和藥物抗體偶聯(lián)比，最后驗(yàn)證其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及生物活性。目前，檢測ADC偶聯(lián)效率和藥物抗體偶聯(lián)比(DAR)的方法主要有紫外分光光度法、疏水作用色譜、反相高效液相色譜、液相色譜偶聯(lián)電噴霧離子化質(zhì)譜、成像毛細(xì)管等電聚焦法等[11-15]。本實(shí)驗(yàn)我們嘗試將IgG與小分子毒性藥物DM1進(jìn)行偶聯(lián)，構(gòu)建了IgG-SMCC-DM1，并通過全波長酶標(biāo)儀微量測定板進(jìn)行紫外光譜驗(yàn)證，旨在建立一種可在常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室評估ADC偶聯(lián)率的微量檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人IgG干粉(上海生工生物，D110501)，SMCC選用磺基修飾的Sulfo-SMCC(Thermo Fisher，22322)，DM1美登素(武漢德美凱)，DMA(N,N-二甲基乙酰胺,sigma，271012)，Sephadex G25脫鹽柱(無錫天演生物技術(shù)有限公司，PC DS-A3)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：全波長酶標(biāo)儀(Thermo multiskan go，μdropTMPlate)。

1.3 緩沖液：緩沖液A,含50 mmol/L磷酸鉀、50 mmol/L氯化鈉、2 mmol/L EDTA、pH 6.5的磷酸鹽緩沖液。偶聯(lián)緩沖液：含100 mM 磷酸鈉和150 mM 氯化鈉及pH為7.2的磷酸鹽緩沖液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 采用兩步法構(gòu)建IgG-SMCC-DM1：①將IgG與SMCC偶聯(lián)構(gòu)建IgG-SMCC，用50 mM磷酸鈉緩沖液溶解親水性連接子SMCC，使SMCC溶液濃度為20 mmol/L。用50 mM磷酸鹽緩沖液配制濃度為10 mg/mL IgG溶液，攪拌IgG溶液，緩慢加入5%濃度的DMA，然后加入等量體積SMCC溶液，使IgG與SMCC的摩爾濃度之比為1:7.5。攪拌狀態(tài)下，室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)溶液用Sephadex G25脫鹽樹脂進(jìn)行過濾，除去過量反應(yīng)物及反應(yīng)副產(chǎn)物，用緩沖液A做洗脫液收集IgG-SMCC溶液。②引入DM1構(gòu)建IgG-SMCC-DM1，將DM1溶解于DMA中至濃度5 mmol/L。用50 mM磷酸鹽緩沖液將IgG-SMCC溶液的濃度稀釋至10 mg/mL，緩慢添加5%濃度的DMA。在攪拌狀態(tài)下，緩慢加入DM1溶液，使連接子與其摩爾濃度為1∶3，使反應(yīng)體系中IgG的終濃度為5 mg/mL，室溫反應(yīng)20 h。反應(yīng)液經(jīng)脫鹽樹脂Sephadex G25 進(jìn)行過濾，收集洗脫樣品用于檢測。

1.4.2 紫外分光光度法檢測樣品的吸收光譜：打開全波長酶標(biāo)儀，設(shè)置波長204～320 nm，在μdropTMplate上滴加檢測樣品2 μl，置于酶標(biāo)儀中檢測?？瞻捉M為偶聯(lián)緩沖液，單一組分樣品為用偶聯(lián)緩沖液溶解的IgG(10 mg/mL)、SMCC溶液(20 mmol/L)、DM1(5 mmol/L)；雙組分樣品為單一組分樣品的混合液，包括：IgG與SMCC 1∶1體積混合液、SMCC與DM1 1∶1體積混合液、IgG與DM 11∶1體積混合液；偶聯(lián)抗體組為純化后收集的樣品。

2 結(jié)果

2.1 IgG和DM1單一組分樣本檢測：為了檢測單一成分在紫外波長范圍的吸光值，選取240～320 nm紫外波長范圍進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示空白組偶聯(lián)緩沖液和SMCC溶液在240～320 nm波長范圍無最大吸收峰，單一的DM1溶液在253 nm處有最大吸收峰，而單一的IgG溶液則在278 nm處有最大吸收峰。

2.2 IgG和DM1混合組分樣本檢測：為了解同一體系中的單一組分是否影響另一組分的吸光值，檢測了不同混合樣本在240～320 nm的紫外吸光值。結(jié)果顯示SMCC對IgG最大吸收峰的出峰時(shí)間有影響，會(huì)使IgG的出峰時(shí)間由278 nm提前至274 nm；而SMCC對DM1的出峰時(shí)間無影響，IgG與DM1相互之間也不影響各自的出峰時(shí)間，而同時(shí)混合IgG、SMCC、DM1組分不影響DM1與IgG的出峰時(shí)間。

2.3 IgG-SMCC-DM1偶聯(lián)物檢測：偶聯(lián)后的IgG-SMCC-DM1溶液經(jīng)脫鹽樹脂Sephadex G25后，共收集了20管樣品，每管約1.5 mL。經(jīng)紫外吸光值檢測，結(jié)果顯示洗脫前期1～3管為緩沖液成分，曲線平緩，無吸收峰出現(xiàn)；當(dāng)收集到第4管時(shí)，開始在280 nm處出現(xiàn)IgG的吸收峰，此時(shí)被洗脫下來的是未結(jié)合DM1的IgG或IgG-SMCC；洗脫中期，第5～11管的樣品在252和280 nm 處均有吸收峰，表明此時(shí)有IgG-SMCC-DM1被洗脫下來，DM1由于Sephadex G25的分子篩作用不會(huì)過早地被洗脫下來；洗脫后期，在第12管之后的樣品只在252 nm處有DM1的吸收峰。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)顯示，DM1溶液在253 nm處有最大吸收峰、IgG在278 nm處有最大吸收峰，而Laurent Ducry的文獻(xiàn)中DM1的最大吸收峰是252 nm，IgG的最大吸收峰是280 nm[1,11]。我們認(rèn)為同一物質(zhì)的出峰時(shí)間會(huì)受多個(gè)因素的影響而略有差異，這些因素包括不同溶解體系(緩沖液和抗體類型不同)和不同測試環(huán)境(測試樣本量和測試儀器不同)。

為了測試同一體系中其他成分對DM1和IgG吸收峰的影響，檢測了4種不同成分樣本的紫外吸光值，結(jié)果顯示SMCC會(huì)使IgG的吸收峰的出峰波長提前，因?yàn)镮gG能與SMCC結(jié)合形成IgG-SMCC，推測快速形成的IgG-SMCC是IgG吸收峰改變的原因，其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步進(jìn)行分析。其它各組分混合后不影響DM1和IgG的出峰波長，但吸光值會(huì)隨混入的物質(zhì)濃度而相應(yīng)的增加。

檢測ADC偶聯(lián)效率和藥物抗體偶聯(lián)比的方法中，疏水作用色譜、反相高效液相色譜、液相色譜偶聯(lián)電噴霧離子化質(zhì)譜、成像毛細(xì)管等電聚焦法等均需用到相應(yīng)的大型儀器設(shè)備及專門用來分離大分子蛋白質(zhì)的色譜柱上。而通常情況下，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室缺乏這些設(shè)備，不能迅速對ADC偶聯(lián)效率進(jìn)行鑒定。如果選用紫外光譜法檢測ADC藥物，使用的紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀則較為常見[16-17]。在本實(shí)驗(yàn)中使用全波長酶標(biāo)儀的微量測定板μdropTMplate檢測，可以準(zhǔn)確地檢測出小樣本量(2 μl)中的抗體偶聯(lián)物。

IgG-SMCC-DM1的構(gòu)建共有2次純化。第一次純化為IgG與SMCC偶聯(lián)后的純化，能夠除去未結(jié)合的SMCC；而第二次純化為IgG-SMCC與DM1偶聯(lián)后的純化，能夠除去未結(jié)合DM1。通過對純化IgG-SMCC-DM1樣品進(jìn)行紫外光譜分析，可初步判斷IgG-SMCC-DM1的質(zhì)量，成功偶聯(lián)DM1的IgG在253～278 nm處都出峰，而沒有偶聯(lián)DM1的IgG和IgG-SMCC則只有253 nm處一個(gè)峰。

需要注意的是，要避免偶聯(lián)時(shí)DM1的使用過量，以免在純化樣品過柱時(shí)速度緩慢，以及DM1過早洗脫下來影響IgG-SMCC-DM1的回收。盡管紫外分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)了微量檢測抗體偶聯(lián)藥物IgG-SMCC-DM1的作用，但是由于沒有直接檢測數(shù)據(jù)證明各成分間的正確連接，需要進(jìn)一步用疏水作用色譜儀、HPLC等精密檢測儀器進(jìn)行驗(yàn)證。