艾滋病的檢測技術(shù)及其研究進展

李海梅 周月蘭 羅必泰 林丹英

（南寧中心血站，廣西 南寧，530000）

艾滋病也被稱為獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所致，經(jīng)相關(guān)研究表明，HIV 感染可以直接破壞人體的免疫細胞，造成機體的免疫功能缺陷，從而增加各種機會性感染和腫瘤的發(fā)生風險，增加感染者的病死率[1]。此外，該病毒的傳染途徑較多，血液、母嬰和性接觸均可造成AIDS 的傳播，對公眾健康構(gòu)成嚴重威脅。目前，遏制AIDS 傳播的關(guān)鍵在于提高HIV 的檢測率以及對感染者采取有效的治療措施，其中HIV 的檢測方式主要以實驗室檢測為主，包含HIV 抗體檢測、病原學檢測、HIV 核酸檢查和CD4+檢測等多種方式[2]?，F(xiàn)筆者就艾滋病檢測技術(shù)的研究進展進行綜述，為提高HIV 的檢測率，遏制AIDS 傳播提高相關(guān)參考。

1.HIV 抗體檢測

HIV 抗體檢測多為初篩試驗，主要可包含酶聯(lián)免疫吸附試驗、化學發(fā)光試驗、免疫熒光試驗、明膠顆粒凝集試驗以及HIV自行檢測等多種方式，但在實踐操作的過程中標本的采集、試劑選擇和處理、溫度調(diào)控、操作人員技術(shù)等多個方面均可檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。故而為提高臨床檢測的準確率還可對HIV 抗體進行補充試驗[3]。目前，HIV 抗體確證實驗是對樣品中血清學檢測為HIV 抗體呈陽性反應(yīng)結(jié)果的最終評價，其方式包括免疫印跡法（WB）、條帶免疫印跡法（SIA）、免疫熒光法（IFA）和放射免疫沉淀法（RIPA），其中WB 是國內(nèi)HIV 抗體確證實驗的首選方式，在晏征[4]等研究發(fā)現(xiàn)，對3494 份HIV 抗體篩查有反應(yīng)標本進行WB 確證試驗發(fā)現(xiàn)，HIV-1 抗體陽性標本1822 份（52.15%）；HIV 抗體不確定標本416 份（11.91%）；HIV 抗體陰性標本1 256 份（39.95%），由此可見WB 法作為HIV 抗體檢測的“金標準”，其穩(wěn)定性、特異性、準確性已得到廣泛認可，可以準確判斷AIDS 病毒感染。

2.HIV 病原學檢測

HIV 病原學檢測可分為p24 抗原檢測和病毒培養(yǎng)兩種，其中前者可將HIV 的感染窗口期縮短至近1 周，在HIV 的早期診斷中具有較高的應(yīng)用價值，現(xiàn)國外多將其用于獻血人員的篩查，然而該檢測方式敏感性較低，只適用于部分早期感染患者和AIDS 晚期患者，臨床的應(yīng)用并不廣泛；而從HIV 感染者的細胞、組織和體液中分離出的病毒是感染確認的最可靠診斷，對不同階段的感染者HIV 的分離率可高達90%以上，但該實驗的實施需要在生物安全P3 級的實驗室進行，技術(shù)要求高，價格昂貴，目前僅限于研究中使用。

3.HIV 核酸檢測

3.1 HIV 核酸定量檢測

當人體感染HIV 后，病毒會在體內(nèi)快速復(fù)制，通過對血漿的檢測可以測定病毒載量（VL），并且從病毒RNA 中提取核酸，通過擴增或放大信號可以使其檢測范圍大約控制在40～107 拷貝/ml，提高VL 測定的準確性，經(jīng)段星[5]等研究證實，血漿病毒載量在5000 拷貝/ml 以上時，核酸定量檢測試驗對于HIV-1感染陽性樣本是一種有效的實驗室診斷方法，此觀點已被正式納入艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范中。如今，臨床常見的定量檢測方式包括反轉(zhuǎn)錄PCR、核酸序列依賴性擴增技術(shù)（NASBA）和支鏈DNA信號擴大系統(tǒng)。反轉(zhuǎn)錄PCR 屬于目標核酸擴增法，是血液篩查和HIV 病毒研究中應(yīng)用最廣泛的定量檢測方式，其中雅培Real time HIV-1 PCR 和羅氏Cobas Taq-Man 兩種檢測方法應(yīng)用最廣泛，它們均由制造商提供專有的自動血漿RNA 處理器和擴增/檢測設(shè)備進行檢測，整個時長大約需要6～8h。NASBA 同樣屬于目標核酸擴增法，主要是借助系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng)體外模擬反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞 內(nèi)的復(fù)制過程從而進行測定，該方式在A～G 各亞型中均有較高的反應(yīng)性，且適用各種抗凝劑，但在樣品的提取和反應(yīng)的測定過程中需要依賴大量手工操作。而支鏈DNA 信號擴大系統(tǒng)屬于直接檢測法，無需對RNA 進行提取和純化，單純通過被檢樣品和外部標記的反應(yīng)強度來確定病毒RNA 含量，不僅具備較高的敏感性，還可重復(fù)操作；但因缺乏內(nèi)部質(zhì)控，難以有效控制在提取和加樣過程中的操作失誤，并且對血清和血漿以外的其他體液樣本無法檢測。

3.2 HIV 核酸定性檢測

HIV 核酸定性檢測主要適用于急性HIV 感染的輔助診斷，同時在感染HIV 的母親所生育的孩子感染情況的輔助診斷和血清學檢測結(jié)果不確定的情況下也可采用該項檢測方式，具體可分為原位雜交、定性HIV 前病毒DNA 檢測以及HIV-RNA 檢測三種手段，其中前者的敏感性較低，而后兩者的敏感性較高。經(jīng)羅慧景[6]研究證實，對217 份HIV 陽性母親所生嬰兒的待檢足底血干血斑（DBS）樣本分別采用In-house 方法與商品化雅培RealTime 艾滋病病毒Ⅰ型（HIV-1）定性檢測試劑盒檢測，結(jié)果顯示兩種檢測方式的一致率為98.6%，Kappa 值為0.835，95%CI 為0.652～1.000，P＜0.05，由此可見，定性HIV 前病毒DNA 檢測方式具有較高的應(yīng)用價值。

4.CD4+T 淋巴細胞計數(shù)檢測

在麻秋英[7]等研究中發(fā)現(xiàn)，HCMV-DNA 陽性的HIV/AIDS 患者，其CD4+T 淋巴細胞水平較血尿陰性患者明顯降低，由此可見，HIV 感染人體后最先攻擊的是CD4+T 淋巴細胞。臨床對此細胞亞群的檢測方式主要以流式細胞術(shù)檢測為主，該方式可以直接獲取CD4+T 淋巴細胞的絕對值，從而了解感染者機體的免疫狀態(tài)和病程進展[8]。目前臨床將HIV 感染的CD4+T 淋巴細胞的數(shù)目大致可分為≥0.5*109/L、（0.2～0.5）*109/L 和＜0.2*109/L 三個等級，對于確定感染者的疾病分期、可能發(fā)生的臨床并發(fā)癥以及治療效果的判斷均有較高的應(yīng)用價值[9]。

5.HIV 耐藥檢測

隨著我國艾滋病患者數(shù)量的不斷增加，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療已逐漸普及，隨之而來的則伴有單一或多種耐藥菌株開始傳播，故而耐藥性檢測現(xiàn)已成為HIV 感染患者抗病毒治療管理中不可或缺的手段。目前，臨床較為成熟且已經(jīng)應(yīng)用于臨床的實驗方法包括HIV 基因型耐藥檢測以及表型耐藥檢測。前者是通過檢測病毒耐藥性的相關(guān)序列來判斷病毒株的耐藥情況，具體包含DNA 序列分析法、分子雜交分析法、干血斑技術(shù)等，其在臨床實踐的過程中具有簡單、快速且費用低的優(yōu)勢，而干血斑技術(shù)作為一種易采集、易保存、生物危險性低等方式，在實驗設(shè)備較差的偏遠地區(qū)以及難采血的患者中具有較高的應(yīng)用價值。但上述方式在應(yīng)用過程中如何合理、正確的解釋檢測的突變結(jié)果，評價對HIV-1 耐藥性的作用則成為臨床需要考慮的問題。表型耐藥性檢測主要是用于檢測病毒在各種抗逆轉(zhuǎn)錄藥物濃度的生長能力，通過檢測抑制50%和90%病毒復(fù)制的藥物濃度，再將重組病毒與野生毒株的藥物濃度進行對比，從而對耐藥性進行判斷，目前，臨床常見的檢測方式包括基于真病毒的表型耐藥性檢測、基于假病毒的表型耐藥性檢測、快速耐藥性表型檢測以及虛擬表型檢測等[10]。

6.總結(jié)

綜上所述，臨床適用于AIDS 診斷的檢測技術(shù)較多，除了上述的HIV 抗體檢測、病原學檢測、HIV 核酸檢查、CD4+檢測技術(shù)及HIV 耐藥檢測外，還可通過血常規(guī)生化檢測和耐藥性監(jiān)測等多種檢測方式進行診斷，不同的檢測方式均具備各自的優(yōu)勢及劣勢，但相比之下，HIV 核酸檢測的方式具有窗口期短、靈敏度高的優(yōu)勢，對于AIDS 的早期診斷、病程檢測、抗病毒治療效果評價等具有較高的意義，而在今后的發(fā)展中也應(yīng)以提高檢測靈敏度、特異性，降低漏檢率、加快檢測速度、確保操作簡單方便，并且還可以降低檢測成本，滿足基本醫(yī)療機構(gòu)的檢測需求為主要目標。