半乳糖凝集素-3對骨關(guān)節(jié)炎成骨細(xì)胞礦化的作用研究

胡勇，楊儉，邱波

武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，武漢430060

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的慢性骨關(guān)節(jié)病，也是引起中老年人關(guān)節(jié)疼痛及功能喪失最主要的原因。研究顯示，65歲以上的人群OA患者占50%，隨著我國人口老齡化逐漸加劇，OA發(fā)病率也呈逐漸上升的趨勢，造成了嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，深入了解并干預(yù)OA發(fā)病機(jī)制，可緩解OA的病理損傷反應(yīng)，減輕社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高患者生活質(zhì)量，并可為有效防治OA提供新的策略。

近年來，人們認(rèn)識到OA并非簡單的軟骨磨損，而是炎癥因子驅(qū)動的關(guān)節(jié)內(nèi)組織的異常重塑[2]。炎癥反應(yīng)驅(qū)動了OA病理變化的發(fā)生及發(fā)展，并且抗炎癥反應(yīng)治療已在OA動物模型上取得成效[3]。作為代表性炎癥因子，半乳糖凝集素-3（galectin-3，Gal-3）在OA關(guān)節(jié)腔表現(xiàn)為高表達(dá)和高分泌，能抑制軟骨下骨基質(zhì)主要成分Ⅰ型膠原α1鏈的表達(dá)，向小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Gal-3會引起關(guān)節(jié)OA樣病變[4]。在OA進(jìn)程早期，軟骨下骨重塑率增加，骨量減少，而在OA晚期，作為成骨細(xì)胞終末分化標(biāo)志的骨鈣素（osteocalcin）表達(dá)增加，雖然軟骨下骨板增厚，骨體積增加，但由于低礦化而導(dǎo)致骨質(zhì)量下降[5]。同時，OA中骨髓水腫，靜脈阻塞和淤滯，軟骨下血管中微栓塞的形成均會導(dǎo)致血流減少，引發(fā)缺血，進(jìn)而在軟骨下骨中產(chǎn)生正常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境的循環(huán)[6?7]。提示氧環(huán)境的差異可能影響OA中的軟骨下骨重塑，而Gal-3在不同氧環(huán)境下如何作用于軟骨下骨尚無相關(guān)報道。軟骨下骨的代謝紊亂和炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致OA的疾病進(jìn)展，本研究探討了Gal-3在正常氧條件和缺氧條件下OA軟骨下骨異常礦化中的作用，旨在為OA治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 患者臨床資料及標(biāo)本獲取

選取就診于武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科患者18例，其中女性12例，男性6例，平均年齡68.4歲，平均體重指數(shù)31.7 kg·m?2?；颊咦栽负炇鹬橥鈺螅谛腥リP(guān)節(jié)置換時獲取軟骨下骨（脛骨平臺）標(biāo)本。根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會公認(rèn)的臨床標(biāo)準(zhǔn)[8]，所有OA患者均經(jīng)風(fēng)濕病學(xué)專家確診。研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院科研倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 軟骨下骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)及處理

去除脛骨平臺表面的軟骨，并取軟骨下骨骨板進(jìn)行分割，制備成骨細(xì)胞[9?10]。當(dāng)成骨細(xì)胞鋪滿后，傳代1次，培養(yǎng)5 d后，分別在正常氧（21%O2）和 缺 氧（0.5% O2）條 件 下 給 予Gal-3（R&D Systems，美國）5 μg·mL?1處理24 h。

1.3 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）

收集已處理完成的細(xì)胞，應(yīng)用TRizol（Qiagen，德國）提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Taqman RT試劑（賽默飛，美國）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計骨鈣素、ERRα基因、sirtuin1基因的qRT-PCR引物（賽默飛，美國），應(yīng)用熒光定量試劑盒檢測mRNA表達(dá)量，RP29作為參照基因，采用2?ΔΔCt法計算相對表達(dá)量?；蛱禺愋砸飳σ姳?所示。

1.4 Gal-3對OA成骨細(xì)胞礦化作用的影響

將一代成骨細(xì)胞均勻鋪種于12孔培養(yǎng)板，使用礦化培養(yǎng)液（常規(guī)培養(yǎng)基+50 μg·mL?1抗壞血酸+50 μg·mL?1β-甘油磷酸）進(jìn)行培養(yǎng)，分別置于21% O2，5% CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中。成骨細(xì)胞每周用PBS、Gal-3（1.5 μg·mL?1）和Gal-3（5 μg·mL?1）處理2次，28 d后收集細(xì)胞并進(jìn)行茜素紅染色，染色后使用Olympus顯微鏡進(jìn)行拍照。提取已染色的礦化細(xì)胞，進(jìn)行礦化定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有定量數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果和分析

2.1 Gal-3對礦化相關(guān)基因表達(dá)的影響

用Gal-3處理一代成骨細(xì)胞24 h后，如圖1A所示，在正常氧條件下，Gal-3抑制骨鈣素表達(dá)近50%（n=7，P<0.05）。對ERRα表達(dá)無顯著影響（n=6，P>0.05），盡管sirtuin1的表達(dá)也有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，P>0.05）。如圖1B所示，Gal-3也抑制低氧條件下骨鈣素的表達(dá)，其表達(dá)率下降35%（n=7，P<0.05）。Gal-3誘導(dǎo)ERRα和sirtuin1表達(dá)分別增加40%（n=6，P<0.05）和60%（n=5，P<0.05）。表明Gal-3在正常氧和缺氧條件下均可抑制骨鈣素的表達(dá)，但僅在缺氧條件下誘導(dǎo)ERRα和sirtuin1的表達(dá)。

圖1 常氧和缺氧條件下Gal-3對礦化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of Gal-3 on the expression of mineralization-related genes under normoxia and hypoxia conditions

2.2 定性評估不同濃度Gal-3對成骨細(xì)胞礦化的影響

如圖2A~C所示，1.5 μg·mL?1Gal-3誘導(dǎo)礦化誘導(dǎo)的作用不明顯，5 μg·mL?1明顯誘導(dǎo)了成骨細(xì)胞礦化。在顯微鏡下觀察，如圖2D~I所示，與對照組相比，20倍（圖2D~F）和100倍（圖2G~I）下的圖像顯示，1.5 μg·mL?1Gal-3誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化，5 μg·mL?1Gal-3延長了誘導(dǎo)時間，細(xì)胞礦化程度更高。結(jié)果表明，不同濃度的Gal-3均促進(jìn)了成骨細(xì)胞的礦化，且高濃度的Gal-3作用更加顯著。

2.3 定量評估不同濃度Gal-3對成骨細(xì)胞礦化的影響

提取上述各處理條件下的礦化色素，用光度法進(jìn)行觀察（波長425 nm）。在正常氧條件下，用Ctrl（PBS）、Gal-3（1.5 μg·mL?1）和Gal-3（5 μg·mL?1）處理成骨細(xì)胞。如圖3所示，茜素紅染色后，獲得了相似的礦化趨勢，但不同條件比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，P>0.05）。結(jié)果表明，雖然在定量評估下，隨著Gal-3濃度的增加，成骨細(xì)胞的礦化程度呈增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

在OA中，軟骨下骨的改變主要表現(xiàn)為骨質(zhì)硬化、骨贅形成、軟骨下骨囊腫和骨髓水腫樣病變。然而，盡管OA末期發(fā)生了骨硬化，但礦化程度明顯降低，暗示發(fā)生了異常的骨重塑[11]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨干骺端生長板中分化的軟骨細(xì)胞中的Gal-3蛋白表達(dá)增加，有利于軟骨細(xì)胞存活和軟骨基質(zhì)礦化[12]。Simon等[13]研究表明，Gal-3可能是成骨細(xì)胞控制礦化部位破骨細(xì)胞生成分子機(jī)制中的重要因素。最近的一項體外研究表明，Gal-3的缺失會導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化和活性的失調(diào)，表現(xiàn)為相關(guān)的成骨基因表達(dá)形式的改變，并與礦化能力的降低相關(guān)[14]。以上研究結(jié)果提示，Gal-3可能在成骨細(xì)胞表型的異常改變中發(fā)揮重要作用，且導(dǎo)致OA末期的骨硬化和低礦化。此外，骨缺血已被證實與骨髓損傷相關(guān)，后者表現(xiàn)為高度低礦化硬化骨形成，并有二次血管重塑、纖維化和多重血栓形成，與局部缺氧程度一致[15]。因此，缺氧微環(huán)境可能是OA硬化骨形成的驅(qū)動因素[16]。然而，無論是在正常氧還是缺氧條件下，目前對Gal-3在OA成骨細(xì)胞異常礦化中的作用及其機(jī)制的研究較少，這一問題的解決有望為OA的治療提供新的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，Gal-3在正常氧和缺氧條件下均能抑制骨鈣素的表達(dá)。作為OA成骨細(xì)胞的終末分化標(biāo)志物，骨鈣素抑制了骨礦化[17?18]，因此，Gal-3對骨鈣素的抑制作用提示成骨細(xì)胞礦化的上調(diào)。本研究結(jié)果表明，Gal-3對骨鈣素的抑制率為49%，高于前人報道的38%[4]，這可能是由于兩項研究中Gal-3的濃度不同引起的。相同濃度的Gal-3在缺氧條件下對骨鈣素表達(dá)的抑制率僅為35%。體外研究表明，慢性缺氧抑制成骨細(xì)胞礦化和骨結(jié)節(jié)的形成[19]。因此，缺氧狀態(tài)可能具有對抗Gal-3對骨鈣素的抑制作用，導(dǎo)致骨結(jié)節(jié)破壞形成。

此外，Gal-3在缺氧條件下可顯著誘導(dǎo)ERRα和sirtuin1的表達(dá)，但在正常氧濃度條件下無明顯改變。據(jù)報道，ERRα與軟骨的形成和維持有關(guān)，可能與共激活有關(guān)[20]，被認(rèn)為是骨生物學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子[21]。然而，在體外實驗中，其是否在成骨細(xì)胞生成或抑制成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用仍存在爭議[20]。隨著年齡的增長，在體內(nèi)作為骨量的正性調(diào)節(jié)因子，成骨細(xì)胞祖細(xì)胞中sirtuin1活性的下降可能導(dǎo)致與年齡相關(guān)的骨量減少[22?23]。本研究結(jié)果顯示，ERRα和sirtuin1在缺氧條件下在成骨中具有積極作用。然而，這種在缺氧條件下基因表達(dá)的上調(diào)是否與OA異常骨硬化有關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

茜素紅染色顯示，Gal-3可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化，從大體形態(tài)及鏡下觀察中均可發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Gal-3濃度越高，成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)越明顯，礦化程度越高，然而，兩組染色劑定量均未發(fā)現(xiàn)顯著的差異，這可能與操作環(huán)境、提取方法等因素有關(guān)。骨鈣素的表達(dá)暗示礦化的下調(diào)。因此，Gal-3礦化染色的差異與本研究中骨鈣素表達(dá)的改變是一致的。雖然模擬成骨細(xì)胞礦化的缺氧條件較困難，但缺氧條件下Gal-3對骨鈣素表達(dá)的抑制提示了類似的趨勢，未來的工作可針對此展開。

綜上所述，Gal-3可能參與了OA成骨細(xì)胞礦化異常的誘導(dǎo)過程，缺氧可能具有對抗這種誘導(dǎo)的作用。Gal-3在OA進(jìn)展中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，為今后治療的靶點(diǎn)篩選提供參考。