遠志皂苷與蓮心堿對七氟烷誘發(fā)新生大鼠急性和遠期認知功能損傷的改善作用及機制分析

韓麗麗，王惠霞，蘭新昂，韓慧梅，孫洪超

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院麻醉科，濟南250031

基于兒科手術(shù)發(fā)展的需求，越來越多的患兒在全身麻醉下接受手術(shù)治療，但全身麻醉對大腦認知功能的影響尚不明確[1]。七氟烷是一種新型吸入性麻醉藥物，其具有對氣道刺激小、麻醉深度易于調(diào)節(jié)以及對循環(huán)系統(tǒng)影響較小等優(yōu)點，是一種理想的誘導(dǎo)全麻的吸入性麻醉藥物[2]。但諸多研究[3?5]亦指出，七氟烷對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育具有一定的毒副作用。有臨床報道指出，盡管肌肉松弛劑能夠促進氣管插管，但在較低濃度七氟烷下進行插管，可能會激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，致使血流動力學(xué)不穩(wěn)定[6]。而七氟烷對嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚未可知，故探究應(yīng)用七氟烷對嬰幼兒進行全身麻醉對其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響至關(guān)重要。

中藥遠志最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可安神益智、交通心腎，遠志皂苷提取自遠志根部，是一種三萜皂苷類化合物[7]。蓮心堿為提取自中藥蓮子心的一種雙芐基異哇琳單醚鍵型生物堿，具有抗炎、抗氧化以及抗抑郁等功效[8]。已有研究[9?10]顯示，遠志皂苷與蓮心堿在治療老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面效果顯著。本研究旨在分析遠志皂苷與蓮心堿對七氟烷誘發(fā)新生急性和遠期認知功能的影響，并探究其可能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物清潔級別新生Sprague Dawley（SD）大鼠36只，出生4~6 d，雌雄不限定，體重8~18 g，由廣州佛爾博生物科技有限公司提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）：20180006。

1.1.2 藥品、試劑與儀器遠志皂苷（上海頸馬生物科技有限公司）；蓮心堿（南京景竹生物科技有限公司）；七氟烷（江蘇恒瑞制藥有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化酶標記二抗（浙江聯(lián)科生物有限公司）；Bcl2、Bax多克隆抗體（美國CST公司）；Caspase-3多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；氧氣檢測儀（杭州立華儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組將36只新生SD大鼠隨機分為中藥組、模型組和空白組，每組12只。將中藥組、模型組暴露于自制的2.5%七氟烷麻醉箱環(huán)境中，2 h·d?1，共3 d；空白組暴露在不含七氟烷的相同麻醉箱環(huán)境中，中藥組于每次麻醉前30 min腹腔注射遠志皂苷與蓮心堿1:1配伍溶液（30 mg·kg?1），模型組和空白組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，同時監(jiān)測氧濃度和七氟烷濃度，維持氧濃度為30%，氧流量為1.5 L·min?1。待新生SD大鼠完全蘇醒后，放回母鼠身邊飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：控制溫度在24~26℃，控制照明12 h光照和12 h黑暗，同時予以充足食物和水。

1.2.2 樣本收集和處理最后一次麻醉后，采用動脈血氣針穿刺各組大鼠左心室，取血，用于檢測血氣指標；大鼠出生60 d時，進行水迷宮測試實驗；大鼠出生70 d時，斷頭取血，用于檢測血清皮質(zhì)酮含量；并取大鼠海馬組織標本，用于WB檢測。

1.2.3 血氣指標檢測最后一次麻醉后，收集各組SD大鼠左心室血清標本3 mL，采用血氣分析儀檢測各組血氣指標動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）以及pH。

1.2.4 皮質(zhì)腦電圖監(jiān)測從開始麻醉時，采用小動物生命體征監(jiān)測儀對各組皮質(zhì)腦電圖進行監(jiān)測，并記錄新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖癲癇波總時長、癲癇波平均時長以及癲癇波數(shù)量。

1.2.5 Morris水迷宮測試實驗大鼠出生60 d時，進行水迷宮測試實驗。將直徑120 cm、高50 cm的黑色圓柱形水池作為水迷宮，在距離池壁30 cm的水下1.5 cm處放置一個直徑10 cm的平臺，水溫控制為22~26℃，將迷宮劃分為4個象限，以監(jiān)測大鼠運動情況。①定位航行實驗：將大鼠沿任意一個象限池壁放入水中，記錄大鼠游泳速度和2 min內(nèi)找到平臺的時間（逃避潛伏期），每天4次，每次間隔30 min，共4 d。②空間探索實驗：第5天時撤掉平臺，將大鼠從距離平臺最遠的象限放入水池中，記錄其60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間，并記錄其探索時間（2 min內(nèi)原平臺停留時間）。

1.2.6 血清皮質(zhì)酮含量檢測以上實驗全部完成后，將各組SD大鼠斷頭處死，收集血清標本3 mL，采用ELISA法檢測血清皮質(zhì)酮含量。

1.2.7 海 馬Bcl2、Bax和Caspase-3表 達采 用Western blot法檢測新生SD大鼠海馬Bcl2、Bax和Caspase-3表達水平，步驟如下：①收集斷頭處死的SD大鼠海馬組織標本，提取總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度，計算各樣品蛋白上樣量；②取適量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，先在55 V恒壓下電泳30 min，待Marker條帶進入分離膠后，調(diào)整電壓為105 V，繼續(xù)電泳1~2 h，待電泳條帶到達底部綠色線位置時，結(jié)束電泳；③電泳完成后，將分離膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并夾好電轉(zhuǎn)夾放入電轉(zhuǎn)盒中，100 mA電轉(zhuǎn)1.5 h，并采用TBST溶液將PVDF膜清洗干凈；④將清洗干凈的PVDF膜放進裝有5%脫脂奶粉配制而成的封閉液中，室溫封閉1~2 h；⑤再次采用TBST溶液將PVDF膜清洗干凈，置于Bcl2（1:1 000）、Bax（1:1 000）、Caspase-3（1:1 000）、GADPH（1:1 000）一抗稀釋液中孵育，并置于4℃冰箱過夜；⑤采用TBST溶液洗膜，重復(fù)3次，并置于辣根過氧化酶標記的二抗稀釋液中，室溫孵育1~2 h；⑥采用TBST溶液洗膜，重復(fù)3次，將膜放入新鮮配制的ECL化學(xué)發(fā)光顯影液中，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，滴加檢測液曝光顯影，拍照，計算各樣品條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 21.0分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗，計量資料全部以均數(shù)±標準差（-x±s）描述，多組組間均數(shù)對比采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組新生SD大鼠血氣指標比較

中藥組、模型組和空白組新生SD大鼠PaO2、PaCO2以及pH比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。提示缺氧和二氧化碳潴留對大鼠腦神經(jīng)元發(fā)育影響不顯著(表1)。

表1 各組新生SD大鼠血氣指標比較（-x±s，n=12）Table 1 Comparison of blood gas indicators of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表1 各組新生SD大鼠血氣指標比較（-x±s，n=12）Table 1 Comparison of blood gas indicators of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

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2.2 各組新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖結(jié)果比較

模型組新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖癲癇波總時長、癲癇波平均時長以及癲癇波數(shù)量顯著高于空白組（P<0.05），中藥組顯著低于模型組（P<0.05）。提示七氟烷誘導(dǎo)可損傷新生大鼠腦功能，予以遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)則對七氟烷誘導(dǎo)的新生大鼠具有一定的腦保護作用（表2）。

表2 各組新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 2 Comparison of cortical electroencephalogram results of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表2 各組新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 2 Comparison of cortical electroencephalogram results of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—與空白組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義；#—與模型組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義。

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2.3 各組新生SD大鼠Morris水迷宮行為比較

定位航行實驗結(jié)果（表3）顯示，中藥組、模型組和空白組新生SD大鼠游泳速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組新生SD大鼠逃避潛伏期顯著長于空白組（P<0.05），中藥組顯著短于模型組（P<0.05）?？臻g探索實驗結(jié)果（表4）顯示，中藥組、模型組和空白組新生SD大鼠穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組新生SD大鼠探索時間顯著短于空白組（P<0.05），中藥組顯著長于模型組（P<0.05）。提示七氟烷誘導(dǎo)后新生大鼠獲取空間信息的能力和記憶儲存能力明顯降低，但予以遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)后得到明顯恢復(fù)。

表3 各組新生SD大鼠定位航行實驗結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 3 Comparison of results of positioning navigation experiment of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表3 各組新生SD大鼠定位航行實驗結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 3 Comparison of results of positioning navigation experiment of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—與空白組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義；#—與模型組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義。

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表4 各組新生SD大鼠空間探索實驗結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 4 Comparison of results of spatial probe test of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表4 各組新生SD大鼠空間探索實驗結(jié)果比較（-x±s，n=12）Table 4 Comparison of results of spatial probe test of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—與空白組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義；#—與模型組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義。

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2.4 各組新生SD大鼠血清皮質(zhì)酮含量比較

模型組新生SD大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著高于空白組（P<0.05），中藥組顯著低于模型組（P<0.05）。提示遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)對七氟烷誘導(dǎo)的新生大鼠腦神經(jīng)發(fā)揮保護作用（表5）。

表5 各組新生SD大鼠血清皮質(zhì)酮含量比較（±s，n=12）Table 5 Comparison of serum corticosterone content of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

表5 各組新生SD大鼠血清皮質(zhì)酮含量比較（±s，n=12）Table 5 Comparison of serum corticosterone content of neonatal SD rats in each group(±s,n=12)

注：*—與空白組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義；#—與模型組相比，差異在P<0.05水平下有統(tǒng)計學(xué)意義。

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2.5 各組新生SD大鼠海馬Bcl2、Bax和Caspase3表達水平比較

模型組新生SD大鼠海馬Bcl2/Bax蛋白表達水平顯著低于空白組（P<0.05），cleaved Caspase-3表達水平顯著高于空白組（P<0.05）；中藥組Bcl2/Bax表達水平顯著高于模型組（P<0.05），cleaved Caspase-3表達水平顯著低于模型組（P<0.05）。提示遠志皂苷與蓮心堿可能是通過介導(dǎo)Bcl2、Bax和Caspase-3信號通路來抑制大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，進而改善七氟烷誘導(dǎo)對新生大鼠遠期認知功能損傷（圖1）。

圖1 各組新生SD大鼠海馬Bcl2、Bax和cleaved Caspase-3表達水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of Bcl2,Bax and cleaved Caspase-3 in the hippocampus of neonatal SD rats in each group

3 討論

七氟烷是包括兒科在內(nèi)的許多外科手術(shù)常用的吸入麻醉劑，通常會導(dǎo)致神經(jīng)損傷和認知功能障礙[11]。動物研究[12]指出，七氟烷全麻誘導(dǎo)可損害幼鼠認知功能，影響海馬轉(zhuǎn)錄水平。因此，研究有效的預(yù)防麻醉所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性的方法具有重要意義。遠志皂苷是遠志的主要活性組分，藥理學(xué)研究[13]顯示，遠志皂苷具有抗衰老、抗氧化、抑制細胞凋亡以及改善認知功能等作用。動物實驗[14]表明，遠志皂苷可以通過抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活，保護帕金森病小鼠多巴胺神經(jīng)元免受炎癥反應(yīng)的影響。已知中藥蓮子心在清熱、鎮(zhèn)痛、止血方面具有顯著功效，蓮心堿作為蓮子心的重要活性成分，可發(fā)揮抗纖維化、抗血栓形成、抗氧化以及抗凋亡等作用[15]。羊小華等[16]報道表明，蓮心堿可顯著抑制七氟烷誘導(dǎo)的新生大鼠皮質(zhì)癲癇樣腦電波圖，且呈劑量依賴效應(yīng)，可能是通過調(diào)控mTOR信號通路來發(fā)揮腦保護作用。本研究通過采用七氟烷誘導(dǎo)新生SD大鼠神經(jīng)元損傷模型發(fā)現(xiàn)，各干預(yù)組新生SD大鼠血氣指標無顯著性差異，均在正常范圍內(nèi)，提示可排除缺氧以及二氧化碳潴留對大鼠腦神經(jīng)元發(fā)育的影響。七氟烷誘導(dǎo)后新生SD大鼠皮質(zhì)腦電圖各項參數(shù)指標的變化表明，遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)對七氟烷誘導(dǎo)的新生SD大鼠具有一定的腦保護作用，對新生SD大鼠急性認知功能具有積極影響。同時本研究結(jié)果還顯示，七氟烷誘導(dǎo)后新生大鼠獲取空間信息的能力和記憶儲存能力明顯降低，但予以遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)后得到明顯恢復(fù)。此外，予以遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)后大鼠血清皮質(zhì)酮含量顯著降低，可能與遠志皂苷與蓮心堿共同保護神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，進而無法激活下丘腦?垂體?腎上腺皮質(zhì)軸，導(dǎo)致皮質(zhì)酮水平降低。

神經(jīng)元凋亡在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和許多神經(jīng)退行性疾病中起著至關(guān)重要的作用。Caspase是神經(jīng)細胞凋亡的有效標志物之一，其介導(dǎo)的信號途徑與細胞凋亡進展密切相關(guān)，一旦Caspase信號途徑被激活，將觸發(fā)一系列程序介導(dǎo)細胞凋亡[17]。此外，Bcl2家族也在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Bcl2、Bax是細胞凋亡過程中的兩種主要調(diào)節(jié)因子，Bcl2抑制凋亡，Bax促進凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，七氟烷誘導(dǎo)的大鼠海馬中Bcl2/Bax顯著下調(diào)，cleaved Caspase-3顯著上調(diào)，而遠志皂苷與蓮心堿干預(yù)后，Bcl2/Bax表達顯著上調(diào)，cleaved Caspase-3表達顯著下調(diào)，表明遠志皂苷與蓮心堿可能是通過介導(dǎo)Bcl2、Bax和Caspase-3信號通路來抑制大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，進而改善七氟烷誘導(dǎo)對新生大鼠遠期認知功能損傷。廖丹瓊等[19]報道也表明，遠志皂苷可改善氧糖剝奪/再復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠海馬NSCs損傷。分析原因為，遠志皂苷與蓮心堿均具有一定的抗炎和抗氧化作用，其機理可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白酶，進而抑制七氟烷誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡；另外，還有可能是通過提高海馬神經(jīng)元內(nèi)抗氧化酶的活性，進而減少氧化應(yīng)激損傷，提示遠志皂苷與蓮心堿具有防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用前景。但本研究氧化還原相關(guān)酶、蛋白等指標未納入分析，后續(xù)有待進一步SD深入探討遠志皂苷與蓮心堿對七氟烷誘發(fā)新生大鼠急性和遠期認知功能損傷的詳細作用機制。

綜上所述，遠志皂苷與蓮心堿可改善七氟烷誘發(fā)新生大鼠急性和遠期認知功能損傷，其機制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)基因Bcl2、Bax和Caspase-3表達有關(guān)，可為臨床神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治提供科學(xué)根據(jù)。