60Co-γ射線輻照滅菌對(duì)固腎生發(fā)丸指紋圖譜和有效成分含量的影響

朱芹，黃湘杰

1.湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411000；2.湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 藥劑科，湖南 湘鄉(xiāng) 411400

固腎生發(fā)丸的功效是固腎養(yǎng)血、益氣祛風(fēng)，臨床用于治療斑禿、全禿、普禿及肝腎之癥狀性脫發(fā)，是由何首烏、黑芝麻、女貞子、熟地黃、枸杞子、羌活、川芎、木瓜、當(dāng)歸、桑椹、丹參、黨參12 味中藥加工制成的中藥復(fù)方制劑[1]。方中重要藥味何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當(dāng)歸均是直接粉碎成細(xì)粉入藥，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版明確規(guī)定，須對(duì)直接入藥的生藥粉進(jìn)行滅菌。目前，中藥常用滅菌方法有濕熱滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌及輻照滅菌，而輻照滅菌作為一種冷滅菌技術(shù)，具有殺菌效果高效、徹底、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)[2-3]。我國(guó)自20 世紀(jì)80 年代開展60Co-γ射線輻照對(duì)中藥滅菌工藝和質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究[4]。1997 年，原衛(wèi)生部頒發(fā)第38 號(hào)文件《允許輻照的藥材品種名錄》[5]，但何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當(dāng)歸均未被列入其中，且無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)60Co-γ射線輻照對(duì)固腎生發(fā)丸中藥原粉影響的研究。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定何首烏、女貞子、川芎、木瓜、當(dāng)歸中有效成分的含量，結(jié)合指紋圖譜的方法，分析10批輻照前后共30份固腎生發(fā)丸樣品指紋圖譜和特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6 個(gè)化學(xué)成分含量，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012A版和SPSS 19.0軟件中配對(duì)樣本t-檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)議，為固腎生發(fā)丸采用60Co輻照滅菌提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括G1311A 型四元梯度泵、G1329A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B 型二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、G1316A 型柱溫箱Agilent-Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；ML204T 型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司）；S300 型超聲波清洗機(jī)（40 kHz，500 W，德國(guó)Elma 公司）；LM61-HG-S30 型優(yōu)普系列超純水機(jī)（南京威美特科學(xué)儀器有限公司）；輻照源為60Co-γ射線輻照設(shè)備（北京易達(dá)測(cè)量技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品特女貞苷（批號(hào)：111926-201906，純度：95.0%）、女貞苷（批號(hào)：111918-201703，純度：94.4%）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，純度：99.4%）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖 苷（批號(hào)：110844-201915，純度：90.7%）、齊墩果酸（批號(hào)：110709-201908，純度：91.7%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，純度：96.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純（美國(guó)默克公司）；磷酸為色譜純（西隴科學(xué)股份有限公司）。

10 批市售固腎生發(fā)丸，吉林省俊宏藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.25 g/丸，批號(hào)分別為20190117（Y1）、20190206（Y2）、20190318（Y3）、20190420（Y4）、20190511（Y5）、20190623（Y6）、20190909（Y7）、20191015（Y8）、20191112（Y9）、20191219（Y10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 輻照方法與微生物限度檢查

取固腎生發(fā)丸供試品10 批，平置于60Co 專用輻照室，分別設(shè)置3、6、9 kGy 3 個(gè)不同輻照劑量及48 h輻照時(shí)間。

隨機(jī)取1 批輻照前后固腎生發(fā)丸，制成1∶10、1∶100、1∶1000 的待測(cè)液，按照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）通則1105 規(guī)定考察輻照前后樣品中微生物的變化情況，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 可以看出，隨著輻照劑量增大，固腎生發(fā)丸的含菌量明顯減少。

表1 固腎生發(fā)丸輻照前后含菌量測(cè)定結(jié)果

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.8% 磷酸溶液[6-8]，梯度洗脫（0～20 min，25%～45%A；20～55 min，45%～48%A；55～60 min，48%～65%A；60～70 min，65%～55%A；70～80 min，55%～25%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（0～20 min，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）、220 nm（20～55 min，特女貞苷、阿魏酸、女貞苷）、320 nm（55～60 min，大黃素）、206 nm（60～80 min，齊墩果酸）；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下，6 個(gè)成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5580，系統(tǒng)適用性良好。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素對(duì)照品各適量，加甲醇制成含特女貞苷212.42 μg·mL-1、女貞苷45.92 μg·mL-1、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷190.86 μg·mL-1、阿魏酸115.18 μg·mL-1、齊墩果酸90.69 μg·mL-1和大黃素96.77 μg·mL-1的溶液，混勻，濾過(guò)，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。冰箱冷藏保存。

2.3.2 供試品溶液的制備 取固腎生發(fā)丸（批號(hào)：20190623）及經(jīng)輻照處理的樣品內(nèi)容物各適量，剪碎，混勻，取約2.0 g，精密稱定，置100 mL 棕色量瓶中，加入55%甲醇約85 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（450 W，40 kHz，水溫：20 ℃）處理45 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用55%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.4 固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜的研究

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取固腎生發(fā)丸（批號(hào)：20190623），按2.3.2 項(xiàng)下方法制備成同一供試品溶液，照2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針。以第一針指紋圖譜為對(duì)照，計(jì)算6 份圖譜相似度，結(jié)果各指紋圖譜相似度結(jié)果均大于0.99，符合指紋圖譜相似度技術(shù)要求（≥0.95），表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取固腎生發(fā)丸（批號(hào)：20190623），按2.2 項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣。計(jì)算相似度（以0 h 進(jìn)樣的色譜圖為參照?qǐng)D譜），結(jié)果6次進(jìn)樣指紋圖譜間相似度均大于0.96，符合指紋圖譜相似度技術(shù)要求（≥0.95），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批固腎生發(fā)丸（批號(hào)：20190623）6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。計(jì)算相似度（以第一次進(jìn)樣的色譜圖為參照?qǐng)D譜），結(jié)果6 次采集的指紋圖譜間相似度均大于0.96，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 固腎生發(fā)丸指紋圖譜的建立及部分共有峰指認(rèn) 取10 批固腎生發(fā)丸及經(jīng)3、6、9 kGy 劑量輻照滅菌后的固腎生發(fā)丸樣品適量，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。分別將輻照前后供試品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012A 版軟件，設(shè)置時(shí)間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點(diǎn)校正[9-10]，分別生成0、3、6、9 kGy 輻照處理后固腎生發(fā)丸的對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算各批不同輻照劑量與對(duì)照指紋圖譜的相似度。從生成的指紋圖譜可以看出，經(jīng)0、3、6、9 kGy劑量60Co-γ射線輻射處理后的固腎生發(fā)丸指紋圖譜中，輻照前后色譜峰位置及共有峰數(shù)目基本一致，共檢測(cè)到23 個(gè)共有峰，通過(guò)與2.3.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品比對(duì)，可確認(rèn)4 號(hào)峰為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、7 號(hào)峰為阿魏酸、11 號(hào)峰為特女貞苷、13 號(hào)峰為女貞苷、18 號(hào)峰為大黃素及21 號(hào)峰為齊墩果酸。色譜圖見(jiàn)圖1，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批固腎生發(fā)丸相似度計(jì)算結(jié)果

圖1 固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜和混合對(duì)照品色譜圖

2.5 固腎生發(fā)丸中6種成分定量分析

2.5.1 線性關(guān)系的考察 分別精密量取2.3.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液按2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以各組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。取混合對(duì)照品溶液，用甲醇倍比稀釋，分別取峰面積信噪比（S/N）為10 時(shí)相應(yīng)對(duì)照品質(zhì)量濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 固腎生發(fā)丸中6個(gè)成分線性關(guān)系考察結(jié)果和定量限

2.5.2 儀器精密度試驗(yàn) 取2.2.1 項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素峰面積的RSD 分別為0.49%、0.37%、0.66%、0.55%、0.71%和0.88%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)：20190623）固腎生發(fā)丸供試品溶液（0 kGy），按2.2 項(xiàng)下條件，分別于0、5、10、15、20、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素峰面積的RSD分別為0.75%、0.65%、0.79%、0.71%、0.84%和0.93%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 耐用性試驗(yàn) 采用3 根規(guī)格均為（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同品牌號(hào)的C18色譜柱（Agilent Prep、Shimadzu、Durashell）進(jìn)行分析，6 個(gè)成分相互之間及與其他各色譜峰之間均能達(dá)良好分離。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批（批號(hào)：20190623）未經(jīng)輻照固腎生發(fā)丸6份，照2.3.2項(xiàng)下方法處理，按2.2 項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.181 3、0.420 8、1.657 4、1.812 2、0.611 6、0.646 5 mg·g-1，RSD 分別為0.97%、0.77%、1.12%、1.01%、0.91% 和0.88%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取未經(jīng)輻照滅菌且已知含量的固腎生發(fā)丸供試品（批號(hào)：20190623）6 份，每份約1.0 g，混勻，精密稱定，分別精密加入特女貞苷0.473 6 mg·mL-1、女貞苷0.100 4 mg·mL-1、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.365 9 mg·mL-1、阿魏酸0.393 3 mg·mL-1、齊墩果酸0.133 5 mg·mL-1、大黃素0.139 3 mg·mL-1混合對(duì)照品溶液5.0 mL，按2.3.2項(xiàng)下方法制備溶液，按2.2 項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各組分加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素的回收率為97.96%～101.29%，RSD 分別為0.94%、0.71%、1.05%、0.45%、0.81%和0.65%。

表4 固腎生發(fā)丸5個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)

2.5.7 樣品測(cè)定 分別取10 批未經(jīng)輻照處理的固腎生發(fā)丸供試品及經(jīng)3、6、9 kGy 劑量輻照處理后的固腎生發(fā)丸供試品，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.2 項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定樣品中特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素含量，利用SPSS 22.0 軟件對(duì)滅菌前后含量進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，考察不同劑量60Co-γ射線輻射滅菌對(duì)固腎生發(fā)丸中6個(gè)化學(xué)成分的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 固腎生發(fā)丸6個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

續(xù)表5

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)表5 中6 個(gè)化學(xué)成分的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)6 個(gè)化學(xué)成分經(jīng)3、6、9 kGy輻照滅菌后與未輻照滅菌樣品的含量采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，輻照劑量為6 kGy 及以下時(shí)特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)劑量達(dá)到9 kGy 時(shí)，特女貞苷和女貞苷含量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選定

固腎生發(fā)丸中何首烏是常用的補(bǔ)益中藥，主要含有二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等成分，《中國(guó)藥典》2020 年版中分別收錄何首烏與制何首烏，其均包含二苯乙烯苷及蒽醌類的含量測(cè)定項(xiàng)，其代表成分2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素是何首烏發(fā)揮功效的特征物質(zhì)基礎(chǔ)，具有補(bǔ)益精血、固腎烏須之功效[11-12]；具有明目烏發(fā)、滋補(bǔ)肝腎之功效的女貞子，其代表成分為環(huán)烯醚萜苷類特女貞苷及女貞苷，藥理研究表明，女貞苷具有抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用[13]；阿魏酸既是《中國(guó)藥典》2020 年版中當(dāng)歸質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，也是川芎質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，主要藥理作用為行血化瘀、改善人體血液循環(huán)系統(tǒng)[14]；2003 年就被列入《藥食同源目錄大全》的木瓜，三萜類成分齊墩果酸是其主要的活性成分，具有保肝、護(hù)腎、調(diào)血脂的藥理作用[15]。中藥指紋圖譜可以對(duì)多指標(biāo)、多組分的質(zhì)量進(jìn)行整體研究，能全面反映中藥中所含的復(fù)雜成分及相互關(guān)聯(lián)，為中藥質(zhì)量控制的全面性、深入性提供了有力的保障[16]。故本研究采用HPLC 建立了固腎生發(fā)丸的指紋圖譜，并對(duì)特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 輻照劑量的選擇

《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》指出，中藥輻照劑量原則上不得超過(guò)10 kGy，綜合以上標(biāo)準(zhǔn)及優(yōu)先從小劑量考察的原則，選定3、6、9 kGy 3 個(gè)劑量。表1結(jié)果顯示，輻照劑量為3 kGy 時(shí)即可達(dá)到中藥制劑微生物標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合表5 含量測(cè)定結(jié)果，故最佳輻照劑量＜6 kGy。

3.3 60Co-γ射線輻照滅菌結(jié)果分析

60Co-γ射線輻照滅菌是利用60Co 產(chǎn)生的γ射線殺滅微生物的過(guò)程。本研究以未輻照固腎生發(fā)丸的指紋圖譜作為參照，不同輻照劑量下所得到的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在＜6 kGy 的輻照劑量下，相似度均大于0.96，說(shuō)明固腎生發(fā)丸的化學(xué)穩(wěn)定性較好；從含量和共有峰數(shù)量方面可以看出，輻照滅菌對(duì)固腎生發(fā)丸無(wú)影響。由表5 含量測(cè)定結(jié)果可知，特女貞苷和女貞苷2種成分在輻照劑量為9 kGy 時(shí)平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低54.09%和47.54%，含量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。特女貞苷中的環(huán)烯醚萜部分通過(guò)其裂環(huán)上的酯鍵與紅景天苷相連，而女貞苷則與酪醇或羥基酪醇等苯乙醇類化合物相連，均屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類多酚化合物[17]，性質(zhì)不穩(wěn)定、酯鍵斷裂，這可能是導(dǎo)致特女貞苷和女貞苷在輻照劑量9 kGy時(shí)含量降低主要原因。

本研究建立了不同劑量60Co-γ輻照滅菌前后的固腎生發(fā)丸HPLC指紋圖譜，同時(shí)，建立了HPLC測(cè)定固腎生發(fā)丸中特女貞苷、女貞苷、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、齊墩果酸、大黃素6 個(gè)成分含量的方法，并通過(guò)相關(guān)軟件比較了輻照滅菌前后6 個(gè)成分含量的變化。研究結(jié)果顯示，經(jīng)60Co-γ輻照滅菌劑量不超過(guò)6 kGy，適用于固腎生發(fā)丸的質(zhì)量控制。