不同產地肉蓯蓉飲片HPLC指紋圖譜與化學模式識別△

畢天琛，楊國寧，王素香，趙丹彤，3，劉延娟

1.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；2.青島科技大學 化工學院，山東 青島 266000；3.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355

肉蓯蓉為多年生草本寄生植物，為列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉蓯蓉C.tubulosa（Schenk）Wight 的干燥帶鱗葉的肉質莖[1]。肉蓯蓉始載于《神農本草經》，為我國傳統(tǒng)沙生名貴補益類中藥，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的功能[1-3]。其主要產地包括內蒙古、寧夏、新疆、甘肅和青海等地[4]。肉蓯蓉的化學成分主要有苯苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、多糖及單萜苷類、生物堿等[4]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版肉蓯蓉品種含量測定項下僅規(guī)定了松果菊苷和毛蕊花糖苷總量，并未對其他成分做出相關規(guī)定。目前，已有關于肉蓯蓉中管花苷A、肉蓯蓉苷A、肉蓯蓉苷C、異毛蕊花糖苷等成分含量測定和指紋圖譜研究的報道[5-12]，但只是對其中幾種指標性成分進行研究，不能全面反映肉蓯蓉飲片整體質量的優(yōu)劣。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜結合化學模式識別法對肉蓯蓉飲片質量進行綜合分析評價，為其質量標準研究提供切實可行的參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；XS105 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；FRQ-1010T 型超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品松果菊苷、毛蕊花糖苷（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111670-201706、111530-201713，純度分別為89.7%、92.5%）；對照品京尼平苷酸（批號：18112101，純度≥98%）、肉蓯蓉苷A（批號：17062001，純度≥95%）、管花苷A（批號：18032105，純度≥98%）、異毛蕊花糖苷（批號：18102404，純度≥98%）、2'-乙酰毛蕊花糖苷（批號19011705，純度≥96%）、管花苷B（批號：17052704，純度≥97%）均購自成都普菲得生物技術有限公司；甲醇、乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；乙酸為優(yōu)級純（德國Merck公司）。

10 批肉蓯蓉飲片均購自市場，經菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院馬海春副主任中藥師鑒定為列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 的干燥帶鱗葉的肉質莖，見表1。

表1 肉蓯蓉飲片樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%乙酸（B），梯度洗 脫（0～7 min，10%～19% A；7～25 min，19%～22%A；25～35 min，22%～25%A；35～36 min，25%～10%A；36～40 min，10%A）；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取各對照品適量，加入50%甲醇溶解制備成含京尼平苷酸0.980 mg·mL-1、松果菊苷1.052 mg·mL-1、肉蓯蓉苷A 1.044 mg·mL-1、管花苷A 0.953 mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.986 mg·mL-1、異毛蕊花糖苷1.078 mg·mL-1、2'-乙酰毛蕊花糖苷1.181 mg·mL-1、管花苷B 0.986 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液。精密量取上述儲備溶液5 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取肉蓯蓉樣品粉末（過四號篩）1.0 g，精密稱定，置于100 mL 棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱量，超聲提取40 min，放冷后加50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取肉蓯蓉飲片（S1）制備的供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積和保留時間。以松果菊苷（4 號峰）為參照峰，分別計算其他16 個色譜峰相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果16 個色譜峰相對峰面積的RSD為0.13%～0.58%，相對保留時間的RSD為0.24%～1.45%，表明該方法的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取肉蓯蓉飲片（S1）制備的供試品溶液，分別室溫放置0、2、4、6、12、24 h后，按照2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積和保留時間。以松果菊苷（4 號峰）為參照峰，分別計算其他16 個色譜峰相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果16 個共有色譜峰相對峰面積的RSD 為0.22%～0.74%，相對保留時間的RSD為0.51%～1.82%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 稱取同一份肉蓯蓉飲片樣品（S1）粉末約1.0 g，精密稱定6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定。以松果菊苷（4號峰）為參照峰，分別計算其他16個色譜峰相對峰面積和相對保留時間，并計算RSD。結果16 個共有色譜峰相對峰面積的RSD 為0.08%～0.26%，相對保留時間的RSD 為0.33%～1.24%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 HPLC 指紋圖譜測定 取不同產地10 批肉蓯蓉飲片樣品，按照2.3 項下方法制備供試品溶液，按照2.1 項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果見圖1。

圖1 10批肉蓯蓉飲片的HPLC疊加指紋圖譜

2.5.2 共有模式的建立及共有峰確定 將2.5.1 項下條件下測定的色譜圖導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012 A 版軟件，以S1 樣品為參考圖譜，時間窗寬度設為0.1 s，中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（圖2）。以4 號峰作為參照峰S，對不同肉蓯蓉飲片的指紋圖譜進行考察，共確定17 個共有峰。

圖2 10批次肉蓯蓉飲片的HPLC對照指紋圖譜

通過對照品溶液比對，指認了其中8 個色譜峰，分別為1 號（京尼平苷酸）、4 號（松果菊苷）、8 號（肉蓯蓉苷A）、9 號（管花苷A）、10 號（毛蕊花糖苷）、11號（異毛蕊花糖苷）、16號（2'-乙酰毛蕊花糖苷）和17號（管花苷B）。結果見圖3。

圖3 肉蓯蓉8種混合對照品HPLC圖

2.5.3 相似度評價 采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”2012 A 版軟件，以樣品的HPLC 對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果10 批樣品的相似度為0.941～0.999，見表2，說明各批樣品之間整體差異性較小。

表2 10批肉蓯蓉飲片樣品的相似度評價

2.6 聚類分析

以4 號峰為參照，以10 批樣品中17 個共有峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行聚類分析，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以歐氏距離為區(qū)間進行聚類分析，生成聚類樹狀圖（圖4）。10 批樣品大致可分為2 類，S1、S3 聚為一類，其余為一類，S1、S3 中4～7、9、11、12 號峰面積均明顯大于其余樣品。S1、S3、S5、S9、S10 產地均為新疆，S2、S4、S7、S8 產地均為內蒙古，但均未聚為一類，說明同一產地肉蓯蓉飲片質量存在差異。

圖4 10批肉蓯蓉飲片聚類分析樹狀圖

2.7 主成分分析

采用SPSS 22.0 軟件對10 批肉蓯蓉飲片樣品中17 個共有峰面積進行主成分分析。結果顯示，共得到4 個主成分因子，特征值分別為8.148、2.852、2.461 和1.326，方差貢獻率分別為47.927%、16.779%、14.474%和7.800%，累積方差貢獻率為47.927%、64.705%、79.179%和86.979%（表3），提示主成分因子1～4 可作為評價不同肉蓯蓉飲片的評價指標。根據因子載荷矩陣表（表4）和因子載荷圖（圖5）可以看出，主成分因子1 與11 個共有峰相關性均較強，特別是峰4～7、9、11和12；主成分因子2 與峰16、17 相關性較強；主成分因子3 與峰3、8、13 和14 相關性較強，特別是峰14；主成分因子4 與峰10 相關性較強。根據各主成分載荷向量乘以各主成分特征值的算術平方根計算各批樣品的綜合得分，結果見表5。其中S1、S3 綜合得分較高，S5、S6、S9、S10 相對較低，與聚類分析結果一致。

表3 肉蓯蓉中主成分特征值和貢獻率

表4 肉蓯蓉中初始因子載荷矩陣

圖5 肉蓯蓉中因子載荷圖

表5 10批肉蓯蓉飲片主成分得分和綜合得分

3 討論

本研究前期對液相條件進行優(yōu)化，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液5 種流動相及8 個梯度洗脫條件，結果以乙腈-0.5%乙酸溶液為流動相時，梯度洗脫效果最好。采用二極管陣列檢測器進行190～400 nm 全波長掃描，結果顯示，在330 nm 波長下色譜峰較多，響應值較高，因此，采用330 nm 作為指紋圖譜檢測波長。綜上，確定了2.1 項下色譜條件作為肉蓯蓉飲片指紋圖譜液相色譜條件。

10 批肉蓯蓉飲片樣品指紋圖譜共確定17 個共有峰，并指認了其中8 個成分，分別為京尼平苷酸、松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷和管花苷B。結果顯示，不同樣品之間相對保留時間相差較小，但相對峰面積有一定差異，說明不同樣品之間部分成分含量存在差異。與對照指紋圖譜的相似度為0.941～0.999，說明不同樣品質量穩(wěn)定、相似度較好。通過聚類分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)，10 批樣品可分為2 類，S1 和S3 為一類，與其他8 批存在明顯差異，同時確定了4 個主成分，篩選出7 個差異性成分，分別是峰4～7、9、11 和12。目前，《中國藥典》2020 年版選用松果菊苷和毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉飲片的含量測定指標成分，本研究發(fā)現(xiàn)7 個成分在各產地肉蓯蓉飲片指紋圖譜中起決定作用，包括松果菊苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷，但不包括毛蕊花糖苷，為評價肉蓯蓉飲片綜合質量提供了新方法。

綜上所述，本研究建立的肉蓯蓉飲片HPLC 指紋圖譜及聚類分析和主成分分析方法可以反映出不同產地的肉蓯蓉飲片的質量水平，可用于肉蓯蓉飲片質量控制及評價，為肉蓯蓉飲片標準研究提供參考。