淡豆豉發(fā)酵制備過程異黃酮變化規(guī)律研究△

趙佳琪，王滿元*，陳紅，王思齊，張海碩，付予劼

1.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

淡豆豉是一味藥用歷史悠久、臨床應(yīng)用廣泛的發(fā)酵炮制類中藥，《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定其原料為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種子（黑豆）[1]，并新增含量測定項(xiàng)，要求本品按干燥品計算，含大豆苷元（daidzein，DAE）和染料木素（genistein，GEE）的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.040%。淡豆豉的炮制過程中既存在大豆異黃酮（soybean isoflavone，SIF）苷類向苷元類的轉(zhuǎn)化[2-3]，也會發(fā)生苷元類物質(zhì)的破壞[4]。新增含量測定項(xiàng)的目的在于以SIF類物質(zhì)發(fā)酵終產(chǎn)物的含量評價淡豆豉的質(zhì)量。歷代醫(yī)家均以“發(fā)透”作為淡豆豉的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)[5]。但《中國藥典》2020 年版淡豆豉含量測定項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)較低，雖然能夠有效區(qū)分淡豆豉的真?zhèn)蝃6]，但不能有效區(qū)分“發(fā)不透（不及）”“發(fā)透（適中）”與“發(fā)過（太過）”的樣品，尚不足以評價淡豆豉的優(yōu)劣，需要進(jìn)一步明確發(fā)酵過程中SIF 變化規(guī)律，為提高淡豆豉質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

天然的SIF 包 括DAE、GEE、黃豆黃素（glycitein，GLE）3 種苷元及這3 種苷元各自的葡萄糖苷、乙?；咸烟擒蘸捅；咸烟擒誟7]。SIF類物質(zhì)最簡便的定量方法為比色法，但輔料中的黃酮、香豆素等酚酸類成分會干擾比色法測定的結(jié)果。同時定量12個SIF的方法最為準(zhǔn)確，但部分對照品不易得，導(dǎo)致該方法推廣較困難[8]。因此，本研究采用紫外-可見分光光度法測定發(fā)酵原料中SIF 類物質(zhì)含量；采用高效液相色譜法（HPLC）同時定量原料及不同發(fā)酵階段樣品中的9 個SIF，以丙二?；蠖管眨╩alonyldaidzin，MDA）、丙二酰基染料木苷（malonylgenistin，MGE）、乙酰基黃豆黃苷（acetylglycitin，AGL）為丙二?；鸵阴；咸烟擒盏拇恚骄縎IF 類物質(zhì)在淡豆豉制備過程中的變化規(guī)律，為優(yōu)化淡豆豉制備工藝、提升其質(zhì)量控制水平提供參考。

1 材料

HWS-150B 型恒溫恒濕箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DFY-200C 型粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；DV215CD 型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2450 型紫外-可見分光光度計、LC-20A 型高效液相色譜儀（包含LC-20AT 泵、SIL-20A 型恒溫自動進(jìn)樣器、CTO-20A 型柱溫箱、SPD-M20A 型檢測器、LC solution 型色譜工作站）均購于日本島津公司。

對照品MDA（批號：PS010932，純度＞95.0%）、MGE（批號：PS010924，純度＞98.0%）均購自成都普思生物科技有限公司；AGL（批號：P20J9F66220，純度＞98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；大豆苷（daidzin，DAI，批號：11738-201302，純度：91.3%，中國食品藥品檢定研究院）；DAE、黃豆黃苷（glycitin，GLI）、染料木苷（genistin，GEI）、GEE（批號分別為G1514019、C1911183、F1827120、H1631055，純度均≥98.0%，Aladdin 公司）；GLE（批號：BCBP9034V，純度≥98.0%，美國Sigma 公司）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；甲醇、冰乙酸（分析純，北京化工廠）；娃哈哈純凈水。

雄黑豆、馬料豆、青蒿、桑葉均購自河北省安國市百草康商貿(mào)有限公司，批號分別為20191113、20191113、20191120、20200215，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院王滿元教授鑒定為正品。其中雄黑豆、馬料豆均為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種子，青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分，桑葉為?？浦参锷orus albaL.的干燥葉。

2 方法

2.1 淡豆豉的發(fā)酵炮制

參考《中國藥典》2020 年版制法，并結(jié)合本課題組發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)制備淡豆豉：挑選出光滑飽滿、無裂紋、不皺縮的馬料豆，洗凈。另取桑葉、青蒿各100 g，加入10 倍量水煎煮0.5 h，用8 層紗布濾過，藥渣加6 倍量水再煎煮0.5 h，濾過，合并藥液，濃縮至1 L。將煎液拌入凈馬料豆1000 g 中，浸泡10 h，俟吸盡后，置蒸具內(nèi)隔水蒸2.5 h，悶0.5 h，取出，晾至40 ℃以下，轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器內(nèi)，用已晾涼的桑葉、青蒿藥渣覆蓋，在溫度為（26±2）℃、濕度為80%的條件下培養(yǎng)4 d，取出，除去藥渣，洗凈，瀝干多余水分，置于密閉容器中，放入（45±2）℃條件下培養(yǎng)15 d，取出，隔水蒸0.5 h，60 ℃烘干，即得。取不同炮制階段的豆豉樣品，見表1。

表1 不同炮制階段豆豉樣品信息

2.2 紫外-可見分光光度法測定原料黑豆中SIF含量

常用于制備淡豆豉的黑豆包括馬料豆和雄黑豆[9]。以DAE、GLE、GEE 為對照品測定雄黑豆、馬料豆中SIF總量。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品DAI、GLI、GEI、GLE、GEI、GEE 適量，分別用80%甲醇配制成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的對照品母液。將DAE、GLE、GEE 對照品母液用80%甲醇依次稀釋為質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 μg·mL-1的系列對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 分別取雄黑豆、馬料豆，粉碎，過40 目篩，精密稱取0.2 g，加80%甲醇10 mL，超聲提取1 h，濾過，取續(xù)濾液稀釋10倍，即得供試品溶液。

2.2.3 檢測波長的選擇 以80%甲醇為空白溶液，在波長190～400 nm 下分別對DAI、DAE、GLI、GLE、GEI、GEE 對照品母液進(jìn)行光譜掃描，確定各成分的最大吸收波長（λmax）。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品含量測定 以80%甲醇為空白溶液，分別在DAE、GLE、GEE 的λmax下測定系列對照品溶液及供試品溶液的吸光度（A）。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），A為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中異黃酮含量。

2.3 HPLC同時定量樣品中9個SIF

2.3.1 樣品質(zhì)量校正 稱量得到不同樣品的平均粒質(zhì)量（M），按照公式（1）～（2）計算樣品相對于原料的質(zhì)量損失及校正系數(shù)。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min，13.0%～23.5%B；35～45 min，23.5%～85.0%B；45～50 min，85.0%B；50～51 min，85.0%～13.0%B；51～60 min，13.0%B）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm；理論板數(shù)按DAE峰和GEE峰計算應(yīng)不低于5000。

2.3.3 對照品溶液制備 分別精密稱取對照品MDA、DAI、DAE、AGL、GLI、GLE、MGE、GEI、GEE 適量，加入對應(yīng)量二甲基亞砜（DMSO）溶解成1 mg·mL-1的對照品溶液，用80% 甲醇配制為各組分質(zhì)量濃度均為50 μg·mL-1的混合對照品母液，將混合對照品母液用80%甲醇倍比稀釋為50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20 μg·mL-1的系列混合對照品溶液。

2.3.4 供試品溶液制備 取原料及制備過程中樣品，粉碎，過40 目篩，精密稱取0.2 g，加80%甲醇10 mL，超聲提取1 h，用0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.3.5 方法學(xué)考察

2.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件測定系列混合對照品溶液，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5.2 精密度試驗(yàn) 取S4 淡豆豉0.2 g，精密稱定，按2.3.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定9個SIF含量，考察精密度。

2.3.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S4 淡豆豉0.2 g，精密稱定，平行6 份，按2.3.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定9個SIF峰面積，考察重復(fù)性。

2.3.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S4 淡豆豉供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定9個SIF峰面積，考察穩(wěn)定性。

2.3.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份已知質(zhì)量濃度的S4 樣品，分別精密加入相當(dāng)于各被測成分100%量的混合對照品，制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測，記錄目標(biāo)成分色譜峰的峰面積，計算加樣回收率。

2.3.6 樣品含量測定 按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件測定供試品溶液，將供試品溶液中各組分的峰面積值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中各成分含量。

3 結(jié)果

3.1 原料黑豆中SIF含量

3.1.1 檢測波長的選擇 經(jīng)過光譜掃描，得到DAI、DAE、GLI、GLE、GEI、GEE 的λmax分別為248、249、256、257、259、259 nm。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，同一苷元結(jié)構(gòu)的葡萄糖苷及苷元具有近似的λmax，故選擇DAE、GLE、GEE 3 個苷元的λmax為吸收波長，分別以3個苷元為對照品進(jìn)行定量。

3.1.2 3 個苷元的線性關(guān)系 如表2 所示，DAE、GLE、GEE 3 個對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的r≥0.999，表明在2～20 μg·mL-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，三者線性關(guān)系良好。

表2 DAE、GLE、GEE線性關(guān)系

3.1.3 不同原料中SIF 含量 不同苷元紫外吸收光譜存在一定差異，導(dǎo)致以不同苷元計算得到的同一樣品中SIF 含量有差別。因此，以不同苷元計算得到的SIF 含量求均值，得到馬料豆中SIF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（3 244.41±925.57）μg·g-1[（11.96±2.82）μmol·g-1]，雄黑豆中SIF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1 655.54±462.97）μg·g-1[（6.10±1.41）μmol·g-1]。由結(jié)果可知，馬料豆中SIF 含量約為雄黑豆的2 倍，在發(fā)酵過程中異黃酮成分的變化會更明顯，且馬料豆籽粒較小而更易“發(fā)透”，便于研究淡豆豉發(fā)酵過程中異黃酮的變化規(guī)律，故選用馬料豆為原料制備樣品。

3.2 樣品中9個SIF含量

3.2.1 樣品質(zhì)量校正 發(fā)酵過程樣品的M見表3，在淡豆豉發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，質(zhì)量損失逐漸增多，導(dǎo)致相同數(shù)量的豆子在發(fā)酵后相較于原料質(zhì)量下降。在進(jìn)行定量測定時，若直接以稱量的質(zhì)量進(jìn)行計算會出現(xiàn)所測成分含量虛高的現(xiàn)象，不能真實(shí)反映淡豆豉發(fā)酵過程中SIF 含量變化，故需以原料質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，按公式（3）對樣品進(jìn)行質(zhì)量校正。

表3 不同炮制階段豆豉樣品的粒質(zhì)量、質(zhì)量損失及校正系數(shù)（,n=3）

表3 不同炮制階段豆豉樣品的粒質(zhì)量、質(zhì)量損失及校正系數(shù)（,n=3）

3.2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 混合對照品及樣品的HPLC圖如圖1 所示，DAI、GLI、GE、MDA、MGE、AGL、DAE、GLE、GEE 的保留時間分別為11.952、13.424、20.602、21.743、31.133、32.079、37.051、40.563、43.801 min。該條件下系統(tǒng)適用性良好。

圖1 SIF對照品及樣品的HPLC圖

3.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系 如表4 所示，所有對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的r≥0.999，表明在0.20～50.00 μg·mL-1對照品線性關(guān)系良好。

表4 SIF對照品的線性關(guān)系

3.2.2.3 精密度試驗(yàn) DAI、GLI、GEI、MDA、MGE、AGL、DAE、GLE、GEE峰面積的RSD分別為0.52%、0.76%、0.65%、1.32%、1.01%、0.98%、0.62%、0.42%和0.13%，表明本方法精密度良好。

3.2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) DAI、GLI、GEI、MDA、MGE、AGL、DAE、GLE、GEE 含量的RSD 分別為1.02%、0.88%、0.46%、1.11%、0.56%、0.92%、0.79%、0.47%和0.38%，表明本方法重復(fù)性良好。

3.2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) DAI、GLI、GEI、MDA、MGE、AGL、DAE、GLE、GEE峰面積的RSD分別為0.62%、0.42%、0.74%、0.79%、0.68%、0.75%、0.55%、0.64%和0.63%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表5，待測成分的加樣回收率在96.72%～97.16%，RSD≤2.90%，表明該方法具有較高的回收率。

表5 淡豆豉中9個SIF的加樣回收率

續(xù)表5

3.2.3 樣品中各組分含量

馬料豆（S0）中9個SIF總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（4 374.23±93.59）μg·g-1[（8.91±0.19）μmol·g-1]，其中苷類占99.10%，苷元占0.90%（表6）。馬料豆中SIF主要以丙二酰基葡萄糖苷、葡萄糖苷形式存在。經(jīng)過浸泡的樣品（S1）中苷類占86.82%，苷元占13.18%。經(jīng)過隔水蒸的樣品（S2）中苷類占95.71%，苷元占4.29%，SIF 主要以葡萄糖苷形式存在。前酵結(jié)束的樣品（S3）中苷類占52.11%，苷元占47.89%，SIF主要以葡萄糖苷和苷元形式存在。后酵階段，苷類含量持續(xù)降低，苷元含量持續(xù)升高，后酵7 d 的樣品（S6）中檢測不到苷類，SIF 僅以苷元形式存在。繼續(xù)發(fā)酵，苷元含量持續(xù)減少，且GEE 減少最為顯著。S6 中苷元含量達(dá)到峰值，為（1 940.2±29.12）μg·g-1，即（7.37±0.82）μmol·g-1，此時樣品中的苷元總量相當(dāng)于SIF 總量，相較于紫外-可見分光光度法測定所得馬料豆中SIF 含量損失了約38%。S6 中DAE 和GEE 總量在進(jìn)行質(zhì)量校正前為0.226%，遠(yuǎn)高于《中國藥典》2020 年版規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

表6 樣品中9種SIF質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） μg·g-1

表6 樣品中9種SIF質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） μg·g-1

注：－表示未檢測到。

4 討論

《本草綱目》記載：“豉，諸大豆皆可為之，以黑豆者入藥”[10]?，F(xiàn)代研究證明，黑豆相比于黃豆、紅豆、綠豆、白蕓豆更適合作為淡豆豉的發(fā)酵原料[11-12]。本研究結(jié)果顯示，馬料豆中異黃酮含量高于雄黑豆，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[13]。同時，馬料豆的籽粒較小而更易“發(fā)透”，有利于縮短淡豆豉的發(fā)酵周期，便于廠家組織生產(chǎn)，有助于改善淡豆豉發(fā)酵周期長、市售淡豆豉質(zhì)量普遍偏低的現(xiàn)狀。

原料馬料豆中SIF 主要以糖苷形式存在，其中以丙二?；咸烟擒?、葡萄糖苷含量較高。在淡豆豉的發(fā)酵過程中，苷類向苷元轉(zhuǎn)化，具體表現(xiàn)為樣品中的丙二?；咸烟擒粘掷m(xù)減少；乙?；咸烟擒铡⑵咸烟擒兆鳛檗D(zhuǎn)化的中間形式，其含量在前處理階段波動、在前酵及后酵階段下降；發(fā)酵產(chǎn)物苷元整體呈波動上升趨勢，最終含量可達(dá)（7.37±0.82）μmol·g-1，約為馬料豆中苷元含量的92 倍。從發(fā)酵階段分析，前處理過程中主要發(fā)生丙二酰基葡萄糖苷向乙?；咸烟擒蘸推咸烟擒盏霓D(zhuǎn)化，經(jīng)過前處理的樣品中SIF 主要以葡萄糖苷形式存在。前酵階段微生物大量繁殖，代謝產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可使苷類大量轉(zhuǎn)化為苷元[14]，前酵結(jié)束時，樣品中苷類和苷元接近1∶1。后酵階段苷類繼續(xù)轉(zhuǎn)化為苷元，后酵7 d 的樣品中無法檢測到SIF 苷類，提示此時樣品中的苷類已最大程度地轉(zhuǎn)化為苷元，樣品達(dá)到了“發(fā)透”的水平。此時樣品中SIF 絕大部分以苷元形式存在，且DAE∶GLE∶GEE≈6∶1∶5。繼續(xù)發(fā)酵，樣品中的苷元含量逐漸降低，且GEE 降低最為明顯。以上結(jié)果表明，發(fā)酵時間不足，樣品中的苷類尚未最大程度轉(zhuǎn)化為苷元，表現(xiàn)為“不及”；發(fā)酵時間過長，會導(dǎo)致苷元進(jìn)一步損失，出現(xiàn)“發(fā)過”的情況。《中國藥典》2020 年版中淡豆豉制法項(xiàng)下明確“置容器內(nèi)再悶15～20 天”，本研究發(fā)現(xiàn)以馬料豆為原料時，該工藝存在“發(fā)過”的風(fēng)險。提示《中國藥典》2020 年版中淡豆豉制法可結(jié)合原料種類及發(fā)酵原理進(jìn)一步優(yōu)化，以便廠家進(jìn)行生產(chǎn)，進(jìn)而提高市場淡豆豉質(zhì)量。

前處理結(jié)束、前酵結(jié)束、后酵第七天時，樣品中DAE 和GEE 的總量分別為0.009%、0.101%、0.226%。對比《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)可知，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)可篩除未經(jīng)發(fā)酵的產(chǎn)品，區(qū)分豆和豉，但不能區(qū)分淡豆豉的發(fā)酵程度和質(zhì)量優(yōu)劣。提示《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)可結(jié)合淡豆豉發(fā)酵過程中異黃酮變化規(guī)律進(jìn)一步完善，如控制DAE 和GEE 總量＞0.100%，可篩除市場中的大部分劣豉，同時促進(jìn)廠家優(yōu)化發(fā)酵工藝，提升市場淡豆豉質(zhì)量。

本研究闡明了淡豆豉發(fā)酵過程中異黃酮的變化規(guī)律，為優(yōu)化淡豆豉制法和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。