苦參開花和授粉生物學(xué)特性的研究△

申國安，吳尚英，王玉龍，郭寶林*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，山西 長治 047100；3.山西省長治市上黨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 長治 047100

苦參Sophora flavescensAit.為豆科槐屬植物，根部入藥，性苦，味寒，歸大腸、膀胱經(jīng)，具有燥濕清熱、止癢殺蟲、利尿的功效，用于治療血痢、便血、黃疸、浮腫、小便不利、疥癩、濕瘡、瘙癢等[1]?？鄥⒑胸S富的次生代謝產(chǎn)物，包括生物堿、黃酮類等。其中，苦參生物堿具有抗蟲、抗病毒、抗菌、抗肝損傷、抗腫瘤、抗胃黏膜損傷、抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、利膽、治療組織細(xì)胞增生和纖維化等作用[2-4]?？鄥⑦€被廣泛用于提取制造生物農(nóng)藥[1,5]，市場(chǎng)需求量很大。但是因?yàn)槠湟吧Y源枯竭，現(xiàn)在主要通過人工栽培生產(chǎn)。

苦參是多年生豆科植物，可以通過地下莖無性繁殖，但繁殖系數(shù)較低。對(duì)于大規(guī)模栽培生產(chǎn)，種子繁殖是最好的方式。豆科植物授粉繁殖方式差異很大，其中部分具有典型的閉花授粉特性，在花朵尚未開放時(shí)已經(jīng)基本完成了授粉，如大豆[6]；還有部分豆科植物自交不親和，必須異花授粉，如紫花苜蓿[7]。目前，苦參的開花習(xí)性和授粉行為等生殖性狀尚缺乏系統(tǒng)的研究。通過前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苦參具有典型的閉花授粉特征，也存在異花授粉的特征。這些研究結(jié)果為苦參種質(zhì)的保存、種子的生產(chǎn)和新品種培育提供了參考。

1 材料

1.1 樣品

研究所用苦參品種為“振苦1 號(hào)”，種植于山西沁縣西安莊苦參繁殖基地?；匚挥跁x東南地區(qū)，處于太行、太岳兩山之間，E112°41′，N36°45′，屬黃土丘陵山區(qū)，平均海拔1000 m，土壤主要為褐土。該地區(qū)屬溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，無霜期170 d，年平均日照時(shí)數(shù)2474 h，年平均氣溫8.9 ℃，年平均降雨量600 mm，相對(duì)濕度60%。實(shí)驗(yàn)期間種植基地日間平均溫度和濕度分別為26 ℃和65%，夜晚平均溫度和濕度為17 ℃和76%。植株經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為苦參Sophora flavescensAit.。

1.2 儀器

HT-400B 型恒溫箱（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）；CX43型生物顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；PXS-A 型解剖鏡（上海普丹光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試藥

蔗糖（批號(hào)：DH326-1，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；聯(lián)苯胺（批號(hào)：B804016-100mg，上海麥克林生化科技有限公司）；過氧化氫［批號(hào)：H1009，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］。

2 方法

2.1 花粉萌發(fā)力實(shí)驗(yàn)

分別配制5%、10%、15%的蔗糖溶液。選取剛剛開放的苦參花朵用于觀察。在載玻片上加1 滴培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液上方輕輕振動(dòng)花藥，使花粉散布于培養(yǎng)液上。將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃黑暗恒溫箱中5 h。顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，每個(gè)樣品隨機(jī)選取3 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。以花粉管長度超過花粉直徑2倍為正常萌發(fā)[8]。

2.2 柱頭可授性實(shí)驗(yàn)

用聯(lián)苯胺-過氧化氫法對(duì)柱頭可授性進(jìn)行測(cè)定[9]。聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液按照1%聯(lián)苯胺-3%過氧化氫-水（4∶11∶22）進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。去掉外面的部分花瓣，露出柱頭。將柱頭浸入聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液，放置1 min，在解剖鏡下進(jìn)行觀察。如果柱頭具有可授性，將在柱頭周圍出現(xiàn)大量的氣泡，附近的溶液變?yōu)樗{(lán)色。

3 結(jié)果

3.1 苦參小花發(fā)育階段的劃分

苦參是多年生草本植物，地上部莖葉在冬季枯死。第二年春天從地下莖萌發(fā)出新芽，長出新的枝條。每個(gè)枝條在接近頂部會(huì)產(chǎn)生2～4 個(gè)小分枝，花序著生在每個(gè)分枝頂端。主花序首先開放，花期6—8 月?？鄥榭偁罨ㄐ?，通常29～35朵小花。花序基部的小花最早發(fā)育，小花自下而上依次開放。每朵小花開放2～3 d。苦參為典型的蝶狀花，包括旗瓣、龍骨瓣、翼瓣、10 枚雄穗和花柱。隨著苦參小花發(fā)育成熟，花朵逐漸變大，同時(shí)雄蕊和雌蕊呈現(xiàn)非常顯著的形態(tài)和生理變化（圖1）?；ㄖ诎l(fā)育成熟的時(shí)候，柱頭出現(xiàn)黏液，有助于黏附花粉粒，促進(jìn)花粉的萌發(fā)。雄蕊在發(fā)育成熟的時(shí)候，花藥發(fā)生破裂，釋放花粉。根據(jù)苦參花器官的外觀大小和雌雄蕊的發(fā)育程度，本研究把苦參小花的發(fā)育過程大致分為7 個(gè)階段（表1）。S1 階段小花體積較小，花瓣長5 mm左右，花瓣呈現(xiàn)淺綠色，完全被綠色的萼片包裹，柱頭沒有黏液；S2 階段小花體積有明顯增大，花瓣微微露白，長約6.8 mm，柱頭已經(jīng)迅速發(fā)育，柱頭開始出現(xiàn)黏液，但是檢測(cè)不到花粉；S3階段小花仍然閉合，體積繼續(xù)明顯增加，柱頭上檢測(cè)不到花粉，S2階段和S3階段柱頭都有黏液，但是還沒有花粉出現(xiàn)在柱頭上；S4 階段小花仍然閉合，體積增大明顯，柱頭上開始能檢測(cè)到花粉，說明已經(jīng)有花藥成熟，開始釋放；S5 階段小花繼續(xù)發(fā)育長大，旗瓣沒有打開，柱頭上有花粉，說明花瓣在沒有打開之前，花藥已經(jīng)成熟并部分釋放；S6 階段，旗瓣張開明顯，從外部可以看到花藥，花藥已經(jīng)破裂，花粉大量釋放。此時(shí)，花瓣剛剛張開不久，花粉活力最高；S7 階段，旗瓣展開，花瓣和花萼之間形成明顯空隙，花藥完全枯萎，但是柱頭繼續(xù)伸長。

表1 苦參小花不同發(fā)育階段的形態(tài)和生理特征（,n=10）

表1 苦參小花不同發(fā)育階段的形態(tài)和生理特征（,n=10）

圖1 苦參小花發(fā)育不同階段的典型特征

對(duì)花器官發(fā)育的觀察結(jié)果表明，小花在開放之前，花粉已經(jīng)成熟，開始釋放。在小花完全開放之后，花粉迅速失活，但是柱頭繼續(xù)伸長，意味著苦參存在異花授粉的可能。異花授粉能夠增加群體的遺傳多樣性，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

3.2 苦參小花不同發(fā)育階段花粉活力與柱頭可授性

在對(duì)苦參小花的形態(tài)特征進(jìn)行研究后，把苦參花器官的發(fā)育分為7 個(gè)階段。進(jìn)一步，對(duì)每個(gè)發(fā)育階段的花粉和柱頭活力進(jìn)行了分析（表2、圖2）?；ǚ墼赟3 階段開始具有活力，但是沒有在柱頭上觀察到花粉，說明此時(shí)花粉只是部分發(fā)育成熟，花藥還沒有開裂，但是在花粉釋放之前，已經(jīng)部分具有活力。在S4、S5 階段，花粉活力急劇增加，在柱頭上也觀察到了花粉粒，說明花藥開始部分釋放。在S6階段，花粉活力達(dá)到最高，此時(shí)花朵已經(jīng)開放。

圖2 不同發(fā)育階段花粉活力和柱頭活性變化規(guī)律（,n=3）

表2 不同發(fā)育階段花粉活力和柱頭可授性分析（,n=3）

表2 不同發(fā)育階段花粉活力和柱頭可授性分析（,n=3）

注：+表示柱頭具有可授性；-表示柱頭沒有可授性。

以上結(jié)果表明，花粉和柱頭的生理活性跟花器官的外部形態(tài)特征具有相關(guān)性，將苦參花器官的發(fā)育劃分為7 個(gè)階段是合適的。當(dāng)花瓣長11.5～11.8 mm，花粉活力最強(qiáng)，此時(shí)是授粉的最佳時(shí)期。在S7階段，小花旗瓣松動(dòng)，可以看到花藥呈現(xiàn)褐色，花粉活力急劇下降。柱頭的發(fā)育速度比花藥要慢，有滯后現(xiàn)象。在S5 階段，當(dāng)花瓣長度＞11.5 mm，花瓣仍然處于閉合狀態(tài)，但柱頭已具有可授性。此時(shí)，花粉活性已經(jīng)較高，可觀察到花粉釋放，柱頭上粘有花粉。但在S7 階段，花粉活力幾乎完全喪失，柱頭仍然有活性，意味著柱頭有能力接收外源的花粉。

3.3 開花后苦參花粉活性的變化

植物開花以后，花粉的活力會(huì)迅速降低，失活的速度因植物而異?；ǚ鄞婊畹臅r(shí)間越長，其能被風(fēng)和昆蟲攜帶的越遠(yuǎn)，越可能實(shí)現(xiàn)異花授粉。分別使用5%、10%、15%的蔗糖溶液進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，使用10%蔗糖溶液，苦參花粉萌發(fā)效果最佳，適合用于花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，這與多數(shù)植物中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。因此，選用10%的蔗糖溶液對(duì)花粉在各種條件下的活力進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果如表3 所示，在室溫（約25 ℃）下，苦參花粉活力在開花后12 h仍然保持在80%以上；12 h 后，花粉活力下降明顯。超過72 h，活力為原來的30%左右，此后花粉活力急劇降低，幾乎全部喪失。結(jié)果說明，開花當(dāng)天苦參花粉的活性最好，但是在72 h 之內(nèi)仍然能保持一定活力，意味著苦參花粉有機(jī)會(huì)被傳播得很遠(yuǎn)。如果進(jìn)行人工授粉，最好在12 h之內(nèi)使用花粉。

表3 苦參開花后不同時(shí)間不同溫度下的花粉活力（,n=3） %

表3 苦參開花后不同時(shí)間不同溫度下的花粉活力（,n=3） %

注：*P＜0.05。

花粉的存活時(shí)間跟溫度有一定的關(guān)系，在低溫情況下，活力保持時(shí)間更長[11-12]。在4 ℃下，苦參花粉失活速度顯著降低，在96 h后，仍有28.89%花粉具有萌發(fā)能力。因此，在育種實(shí)踐中，可以把花粉放在4 ℃保存，適當(dāng)延長花粉的活性，解決花期不遇的問題。

3.4 苦參柱頭可授性的日間變化

植物柱頭活力在1 d中會(huì)有一定的變化，多數(shù)植物的柱頭活力在上午較高。檢測(cè)1 d中柱頭活力最高的時(shí)間段，可以幫助確定最佳的人工授粉時(shí)間，對(duì)雜交育種具有重要的指導(dǎo)意義。選用苦參處于S6 階段的小花，用于觀察柱頭可授性在1 d的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在7：00—9：00，柱頭可授性最強(qiáng)，9：00之后，柱頭可授性下降，13：00 之后，柱頭失去可授性，但在19：00 柱頭的可授性得到一定恢復(fù)。這些結(jié)果說明，苦參柱頭上午活力強(qiáng)，因此人工雜交授粉最好在9：00 之前進(jìn)行?？鄥⒅^活性在傍晚有所恢復(fù)，可能是受到內(nèi)在的生物節(jié)律調(diào)控，也可能是因?yàn)橹^可授性受到外部環(huán)境因素影響，與溫度、濕度有一定關(guān)系。中午溫度高、濕度低，導(dǎo)致柱頭活性降低，這一點(diǎn)需要未來繼續(xù)深入研究。

4 討論

研究植物的生殖特性，特別是花發(fā)育的過程，對(duì)育種實(shí)踐和理論研究具有重要的指導(dǎo)意義。豆科植物的花發(fā)育具有獨(dú)特性[13-15]，但是苦參的花發(fā)育研究較少。本研究把苦參的小花發(fā)育分為7 個(gè)時(shí)期，不僅參考了小花發(fā)育的外觀特征變化，還考慮了花粉的活性和柱頭的授粉能力，能夠反映花器官形態(tài)和生理特征的重要轉(zhuǎn)變階段，為深入研究苦參的傳粉和生殖發(fā)育提供了參考。這種劃分與其他豆科植物上的研究結(jié)果類似，如根據(jù)大豆花朵由幼蕾至花冠開放的特征將其劃分為9個(gè)時(shí)期[16]。

花的發(fā)育主要涉及雌雄生殖器官的發(fā)育?？鄥⑿廴锏陌l(fā)育很快，在花朵完全開放之前，已經(jīng)發(fā)育成熟，花粉具有授粉的活力。雖然雌蕊發(fā)育滯后于雄蕊的發(fā)育，但是在花朵沒有開放之前，花柱已經(jīng)成熟并出現(xiàn)黏液，具有了可授性。尤其是在花朵開放之前，花粉已經(jīng)破裂釋放，柱頭上可以觀察到黏附有花粉粒，說明苦參呈現(xiàn)出典型的閉花授粉行為。因?yàn)樵陂_花之前授粉已經(jīng)進(jìn)行，所以在做雜交育種的時(shí)候，去雄操作應(yīng)該在小花發(fā)育的S3、S4 階段之間進(jìn)行。如果去雄太晚，雄蕊破裂，花粉大量釋放，可能已經(jīng)完成授粉。柱頭的活力在上午9:00 之前最強(qiáng)，所以去雄和授粉以上午為最好。柱頭的活力可以持續(xù)很長時(shí)間，所以人工授粉可以在去雄之后連續(xù)3 d 多次進(jìn)行，增加授粉成功幾率。