基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的地龍平喘作用機(jī)制研究△

馬韞楠，吳婭麗，鐘宛凌，汪文杰，楊萬(wàn)青，張經(jīng)緯，李鵬躍，杜守穎

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488

地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗環(huán)毛蚓P.vulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓P.pectiniferaMkhaeken的干燥體[1]。地龍始載于《神農(nóng)百草經(jīng)》，性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱止痙、平肝熄風(fēng)、通經(jīng)活絡(luò)、平喘利尿等功效?，F(xiàn)代研究表明，地龍主要含有氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽、脂肪酸、核苷酸等成分，具有平喘、降壓、抗凝血、解熱鎮(zhèn)痛等藥理作用[2-3]。

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘，是由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種氣道炎性細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病[4]。哮喘誘因較多，患者常出現(xiàn)可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等。目前臨床治療哮喘常用的藥物有抗膽堿能藥物、吸入型糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動(dòng)劑、磷酸二酯酶抑制劑等[5]，但尚無(wú)法徹底治愈。哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，基礎(chǔ)證候可分為外寒證、痰飲證、痰熱證、腎氣虛證等[4]。地龍是中醫(yī)臨床治療熱哮證哮喘的常用藥，其組方廣泛應(yīng)用于小兒哮喘、咳嗽變異性哮喘、頑固性哮喘等疾病[6-9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，地龍?jiān)谥袊?guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬(wàn)方、維普、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)1988—2018 年治療哮喘有確切療效的1132 條方劑研究中出現(xiàn)470 次，頻次僅次于麻黃、甘草和苦杏仁[10]。地龍?zhí)崛∥镆驯蛔C明對(duì)動(dòng)物哮喘模型、離體支氣管平滑肌誘導(dǎo)收縮模型和炎癥細(xì)胞模型具有干預(yù)作用[11-12]，但其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)分析等多種技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)-成分等相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠整體性、系統(tǒng)性、多層次地闡明藥物的作用機(jī)制，符合中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的特點(diǎn)，已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域重要的研究方法[13]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，基于文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果和多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲得了地龍化學(xué)成分干預(yù)哮喘的靶點(diǎn)和信號(hào)通路，構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合網(wǎng)絡(luò)分析和基因富集分析結(jié)果，對(duì)地龍平喘的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行了合理的推測(cè)，并采用豚鼠離體氣管平滑肌誘導(dǎo)收縮模型驗(yàn)證了地龍?zhí)崛∥飳?duì)膽堿能受體興奮導(dǎo)致的氣管平滑肌收縮的抑制作用，為地龍的藥理學(xué)研究提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Hartley品系健康豚鼠，體質(zhì)量300～350 g，由北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0006。所有操作均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)相關(guān)倫理學(xué)要求（審批編號(hào)：2020102703）。

1.2 試藥

滬地龍藥材由云南永安制藥有限公司提供（批號(hào)：2020051101），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)杜守穎教授鑒定為通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgarisChen 的干燥體；鹽酸毛果蕓香堿（純度≥98%，批號(hào)：B28193）、氨茶堿（純度≥98%，批號(hào)：B24219）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；克-亨氏液為自制（取NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、葡萄糖2 g，超純水溶解至1 L，pH為7.4）。

1.3 儀器

JZJ01 型張力換能器、RM6240B 型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）；ZRX-28952型麥?zhǔn)显〔郏ū本┲腥鹣榭萍加邢薰荆?/p>

2 方法

2.1 地龍化學(xué)成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)檢索CNKI（https://www.cnki.net/）、百鏈數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.blyun.com/）和PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中地龍化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)[14-18]，收集地龍的化學(xué)成分，利用ChemDraw 軟件繪制各化合物的分子結(jié)構(gòu)并保存為sdf（*.sdf）格式文件。

將地龍化學(xué)成分的sdf 格式文件上傳至SwissADME 平 臺(tái)（http://www.swissadme.ch/）[19]，篩選Pharmacokinetics 項(xiàng)下腸胃吸收（GI absorption）結(jié)果為“High”，并且Druglikeness 項(xiàng)下5 種類(lèi)藥性預(yù)測(cè)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結(jié)果中有2 個(gè)及2 個(gè)以上為“Yes”的化合物作為具有較好口服生物利用度和類(lèi)藥性的活性化合物。將活性化合物sdf 格式文件上傳至SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺(tái)[20]，物種選擇“Homo Sapiens”，以probability＞0為篩選條件，對(duì)化合物的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，建立地龍活性成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.2 哮喘疾病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“Asthma”“Bronchial Asthma”“Cough-Variant Asthma”為關(guān)鍵詞，檢索OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)，將所收集的基因靶點(diǎn)去冗余，即為哮喘相關(guān)靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理。

2.3 地龍平喘作用靶點(diǎn)的篩選

將地龍活性化合物相關(guān)靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)利用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，獲取地龍活性成分與哮喘疾病的共同靶點(diǎn)，即為地龍平喘的作用靶點(diǎn)。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將2.3 項(xiàng)下得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https://version-11-0.string-db.org/），“Organism”設(shè)為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)置為“High confidence（0.700）”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將PPI 網(wǎng)絡(luò)的tsv 文件導(dǎo)入Excel 表格，利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理，用Cytohubba插件計(jì)算評(píng)分篩選核心靶點(diǎn)。

2.5 基因富集分析

通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org/）對(duì)地龍平喘作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）分析。GO 分析設(shè)定閾值P＜0.05，選取生物過(guò)程（biological process，BP）中排名前20 的條目進(jìn)行可視化。KEGG 分析設(shè)定閾值P＜0.05，將得到的信號(hào)通路進(jìn)行可視化。根據(jù)KEGG分析結(jié)果，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.6 地龍?zhí)崛∥飳?duì)離體氣管平滑肌收縮模型作用驗(yàn)證

2.6.1 地龍?zhí)崛∥镏苽?取地龍藥材10 g，加純水40 mL勻漿2 min，8000 r·min-1離心10 min（離心半徑為13.5 cm），分離上清液作為提取物，每毫升提取物相當(dāng)于地龍藥材0.25 g；采用Bradford 法測(cè)定提取物的蛋白含量。

2.6.2 豚鼠離體氣管平滑肌螺旋條標(biāo)本的制備 豚鼠猛擊頭部處死后迅速取出氣管，浸沒(méi)于預(yù)熱至37 ℃、氧氣飽和的克-亨氏液中，小心剝離支氣管周?chē)M織，將其由一端向另一端剪成螺旋形條狀，寬2～3 mm，長(zhǎng)3～4 cm。將制備的螺旋條置于盛有克-亨氏液的37 ℃恒溫通氧浴槽中，兩端用細(xì)繩結(jié)扎，一端系于浴槽底部固定鉤，另一端連接張力換能器。將生物信號(hào)采集系統(tǒng)與張力換能器連接，記錄平滑肌張力的變化，調(diào)節(jié)標(biāo)本初始負(fù)載為1.0 g，穩(wěn)定40 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.6.3 地龍?zhí)崛∥飳?duì)豚鼠離體氣管平滑肌張力的影響 待離體氣管平滑肌螺旋條張力穩(wěn)定后，向培養(yǎng)液體積為22 mL 的浴槽中分別加入0.9%氯化鈉溶液、藥材終質(zhì)量濃度為5.556 g·L-1的地龍?zhí)崛∥锖徒K質(zhì)量濃度為2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液，觀察藥物對(duì)正常狀態(tài)下離體氣管平滑肌張力的影響并記錄誘導(dǎo)后張力，每次誘導(dǎo)觀察后更換浴槽內(nèi)的培養(yǎng)液。

待離體平滑肌張力穩(wěn)定后，加入終質(zhì)量濃度為2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液，誘導(dǎo)氣管平滑肌收縮，平滑肌收縮張力達(dá)到穩(wěn)定后分別加入地龍?zhí)崛∥锸购銣卦〔壑械牡佚埶幉馁|(zhì)量濃度依次為2.273、5.556、10.870 g·L-1，陽(yáng)性對(duì)照組加入終質(zhì)量濃度為0.114 g·L-1的茶堿和0.9%氯化鈉溶液，每次加藥后更換浴槽內(nèi)的培養(yǎng)液。記錄誘導(dǎo)收縮后平滑肌張力與給藥后平滑肌張力，按照公式（1）計(jì)算舒張率。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)6次。

2.6.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 地龍活性化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)文獻(xiàn)檢索收集地龍中化合物，并通過(guò)SwissADME 平臺(tái)篩選獲得活性化合物71 個(gè)，包括氨基酸、脂肪酸（酯）、嘌呤和含氮化合物等其他小分子，通過(guò)SwissTargetPrediction 平臺(tái)預(yù)測(cè)并收集這些化合物的靶點(diǎn)，去重后得到化合物潛在靶點(diǎn)828個(gè)。檢索OMIM 和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，共收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)145 個(gè)。將化合物潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)經(jīng)Venny 2.1網(wǎng)站繪制韋恩圖（圖1）分析后，獲得2個(gè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集的交集靶點(diǎn)，即地龍平喘的作用靶點(diǎn)67個(gè)，見(jiàn)表1。與共同靶點(diǎn)有映射關(guān)系的地龍平喘活性化合物共56個(gè)，見(jiàn)表2。

圖1 地龍化合物潛在靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)的韋恩圖

表1 地龍化合物與哮喘的共同靶點(diǎn)

表2 地龍潛在平喘活性成分

3.2 地龍平喘作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將地龍平喘作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢(xún)靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化分析，獲得靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為58，邊數(shù)為168，平均節(jié)點(diǎn)度值為6。通過(guò)CytoHubba 插件評(píng)估靶點(diǎn)蛋白質(zhì)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的連接作用程度，選取12 種算法排名前20的靶點(diǎn)中出現(xiàn)8 次以上的靶點(diǎn)為PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，共9 個(gè)，分別為細(xì)胞色素P450 3A4（CYP3A4）、細(xì)胞色素P450 1A1（CYP1A1）、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7（UGT2B7）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、前列腺素E2受體EP2 亞型（PTGER2）、細(xì)胞色素P450 2C9（CYP2C9）、細(xì)胞色素P450 2C19（CYP2C19）、β2-腎上腺素受體（ADRB2）、細(xì)胞色素P450 1A2（CYP1A2）。

圖2 地龍平喘作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

3.3 GO生物功能注釋和KEGG通路富集分析

GO 分析結(jié)果表明，地龍平喘作用的67 個(gè)潛在靶點(diǎn)能夠調(diào)控40 個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括血液循環(huán)（blood circulation）、花生四烯酸代謝過(guò)程（arachidonic acid metabolic process）、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)（regulation of neurotransmitter levels）、化學(xué)突觸傳遞（chemical synaptic transmission）、腺苷受體信號(hào)通路（adenosine receptor signaling pathway）等，選取排名前15 的條目進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖3。該結(jié)果提示，地龍平喘活性化合物可以通過(guò)參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮作用。

圖3 地龍平喘作用靶點(diǎn)的GO生物過(guò)程分析

KEGG 通路富集分析表明，地龍平喘作用靶點(diǎn)主要參與15 條信號(hào)通路的調(diào)控，包括膽堿能突觸（cholinergic synapse）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、環(huán)磷酸腺苷信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）等，將結(jié)果進(jìn)行可視化，見(jiàn)表3。

表3 地龍平喘作用靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

結(jié)合地龍平喘活性化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)與KEGG分析的信號(hào)通路結(jié)果，通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。該網(wǎng)絡(luò)包含138 個(gè)節(jié)點(diǎn)、530 條邊，其中地龍平喘活性成分56 個(gè)，作用靶點(diǎn)67個(gè)，信號(hào)通路15條。分析結(jié)果顯示，地龍中化合物分子的平均度值為8，氨基酸、脂肪酸（酯）、核苷酸、含氮化合物等其他分子的平均度值分別為2、13、5 和7，度值最高的化合物是肉豆蔻烯酸和9-十四碳烯酸，度值均為23。

圖4 地龍平喘作用的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

該網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)的化合物-靶點(diǎn)映射平均度值為6，度值最高的靶點(diǎn)為皮質(zhì)類(lèi)固醇11-β-脫氫酶同工酶1（HSD11B1），度值為22。其他度值較高的靶點(diǎn)還有糖皮質(zhì)激素結(jié)合球蛋白（SERPINA6）、腺苷受體A3（ADORA3）、PTGER2、HSD11B2、PTGS2等。

3.5 地龍?zhí)崛∥飳?duì)離體氣管平滑肌收縮模型作用驗(yàn)證

3.5.1 地龍?zhí)崛∥镏苽?按2.6.1 項(xiàng)下方法平行制備3 批地龍?zhí)崛∥?，通過(guò)Bradford 法測(cè)定3 批提取物的蛋白質(zhì)量濃度為（1.308±0.004）mg·mL-1，RSD為0.32%，說(shuō)明通過(guò)該方法制備的地龍?zhí)崛∥锏牡鞍缀枯^穩(wěn)定。

3.5.2 地龍?zhí)崛∥飳?duì)豚鼠離體氣管平滑肌張力的影響 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液能夠較好地引起豚鼠離體氣管平滑肌螺旋條的收縮，使氣管平滑肌張力顯著上升。與0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組比較，地龍?zhí)崛∥?.556 g·L-1對(duì)正常狀態(tài)下的離體氣管平滑肌張力無(wú)明顯影響。與0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥氨茶堿能顯著抑制毛果蕓香堿誘導(dǎo)產(chǎn)生的收縮作用，使氣管平滑肌張力下降；質(zhì)量濃度為2.273、5.556、10.870 g·L-1的地龍?zhí)崛∥锞懿煌潭鹊匾种泼|香堿引起的氣管平滑肌收縮，且舒張率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)表4。0.9%氯化鈉溶液、氨茶堿及不同質(zhì)量濃度的地龍?zhí)崛∥飳?duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的氣管平滑肌收縮的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同質(zhì)量濃度地龍?zhí)崛∥飳?duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)的氣管平滑肌收縮的影響

表4 地龍?zhí)崛∥飳?duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)豚鼠離體氣管平滑肌收縮模型的作用（,n=6）

表4 地龍?zhí)崛∥飳?duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)豚鼠離體氣管平滑肌收縮模型的作用（,n=6）

注：藥物對(duì)正常離體氣管平滑肌的影響與0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組比較，△△△P＜0.001；藥物對(duì)毛果蕓香堿誘導(dǎo)離體氣管收縮模型的影響與0.9%氯化鈉溶液對(duì)照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 討論

地龍的化學(xué)成分種類(lèi)繁多，作用機(jī)制復(fù)雜。本研究構(gòu)建了地龍治療哮喘的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件對(duì)地龍活性成分的度值分析得出，脂肪酸（酯）的平均度值最高，脂肪酸類(lèi)成分作用的靶點(diǎn)共55 個(gè)，占研究靶點(diǎn)總數(shù)的82.1%，并且該55 個(gè)作用靶點(diǎn)覆蓋了KEGG 富集的15 條通路。該結(jié)果表明，地龍中脂肪酸類(lèi)成分可能通過(guò)多種途徑干預(yù)疾病，產(chǎn)生平喘作用。地龍含多種不飽和脂肪酸如α-亞麻酸等。ω-3 多不飽和脂肪酸可以通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活化等多種機(jī)制調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫功能[21]。研究證明，急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）治療中加用ω-3多不飽和脂肪酸可對(duì)患者機(jī)體的免疫功能和炎癥反應(yīng)起到一定的調(diào)節(jié)作用，并改善氣體交換能力[22]。周明眉等[23]證明了地龍酸性部位可降低過(guò)敏性哮喘模型小鼠支氣管灌洗液（BALF）中的嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）水平，調(diào)整細(xì)胞因子輔助性T 細(xì)胞1 型細(xì)胞因子/輔助性T 細(xì)胞2 型細(xì)胞因子（Th1/Th2）平衡，起到抗炎和抗過(guò)敏作用。褚襄萍[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，地龍酸性部位為平喘活性部位，共鑒定出該酸性部位含有的12 種脂肪酸；并且發(fā)現(xiàn)，酸性部位中去除脂肪酸類(lèi)中低極性成分后，剩余的高極性成分降低哮喘小鼠BALF中EOS細(xì)胞數(shù)量的作用減弱，說(shuō)明地龍脂肪酸對(duì)哮喘過(guò)程中炎癥細(xì)胞水平有潛在的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

目前文獻(xiàn)報(bào)道中認(rèn)為，次黃嘌呤可能是地龍平喘的重要活性成分之一。劉君怡[24]用含5%～20%甲醇的乙酸乙酯提取地龍平喘活性部位并進(jìn)行了分離，得到了主要成分為核苷類(lèi)（包括次黃嘌呤）的流分，并證明該流分可能通過(guò)抑制白三烯B4（LTB4）水平、促進(jìn)Th1 細(xì)胞分泌γ-干擾素（IFN-γ）和Th2 細(xì)胞凋亡，改善平滑肌收縮并調(diào)節(jié)患者機(jī)體的免疫平衡，進(jìn)而發(fā)揮平喘作用。本研究中次黃嘌呤的作用靶點(diǎn)包括乙酰膽堿酯酶（ACHE）和腺苷受體（ADORA）家族。

本研究中氨基酸的平均度值水平較低，但地龍中氨基酸的含量較高，對(duì)地龍的平喘作用可能有較大的貢獻(xiàn)。KEGG 分析結(jié)果顯示，地龍平喘作用可能與色氨酸代謝通路有關(guān)，脂肪酸、次黃嘌呤、含氮化合物等多種小分子參與了該通路的調(diào)節(jié)。色氨酸代謝產(chǎn)物有助于特異性免疫治療減輕氣道炎癥作用，其機(jī)制與調(diào)控Th17 及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）分化有關(guān)[25]。褚襄萍[12]從地龍平喘活性部位中分離出了主要成分為氨基酸的高極性部位，實(shí)驗(yàn)證明，該部位降低哮喘模型小鼠BALF上清液中免疫球蛋白E（IgE）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、IL-5、IL-13 水平的作用和總活性部位相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故推斷氨基酸可能是地龍發(fā)揮平喘作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，地龍中的一些含氮類(lèi)化合物如4-（辛烷氧基）苯胺、二氫辣椒素和花生四烯酰胺等在本研究中具有較高的度值，可能與地龍其他成分共同發(fā)揮平喘作用。

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性（AHR）疾病，氣道炎癥是哮喘AHR 的基礎(chǔ)，無(wú)論過(guò)敏性還是非過(guò)敏性哮喘氣道炎癥都以EOS 浸潤(rùn)和激活為最終共同途徑[26]?；ㄉ南┧幔ˋA）的生化代謝過(guò)程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其代謝產(chǎn)物白三烯（LT）和前列腺素（PG）是一類(lèi)活性較強(qiáng)的炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，造成支氣管痙攣，增加血管通透性，引起氣道的水腫[27]。GO 生物過(guò)程分析結(jié)果顯示，地龍活性化合物可通過(guò)花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、PTGS1、PTGS2 等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)AA 代謝過(guò)程，推測(cè)該過(guò)程的調(diào)節(jié)是地龍?zhí)崛∥镆种葡Ｐ蛣?dòng)物BALF中EOS水平的主要途徑之一。KEGG分析結(jié)果表明，地龍中的化合物可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞FcεRI 受體信號(hào)通路，該通路與對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的激活密切相關(guān)[28]，廣地龍可通過(guò)抑制NF-κB活化產(chǎn)生抗炎活性[11]。

膽堿能神經(jīng)通過(guò)釋放乙酰膽堿作用于氣道內(nèi)各效應(yīng)細(xì)胞上的M1 和M3 型膽堿能受體而產(chǎn)生興奮作用，從而導(dǎo)致氣道平滑肌收縮[29]。KEGG 分析結(jié)果顯示，地龍的平喘作用可能與膽堿能神經(jīng)突觸（cholinergic synapse）信號(hào)通路有關(guān)，涉及靶點(diǎn)為乙酰膽堿酯酶（ACHE）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體（CHRM）家族。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)離體氣管誘導(dǎo)收縮模型實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了地龍?zhí)崛∥飳?duì)于膽堿能受體興奮引起的氣管平滑肌收縮的舒張作用。離體氣管法是一種常用的篩選平喘藥的實(shí)驗(yàn)方法，具有快速、方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，并可直接觀察到藥物對(duì)氣管平滑肌的收縮和舒張作用[30]。毛果蕓香堿是一種膽堿能受體激動(dòng)劑，通過(guò)作用于氣管平滑肌上分布的M 型膽堿受體導(dǎo)致氣管平滑肌收縮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的地龍?zhí)崛∥锬懿煌潭鹊匾种颇憠A能神經(jīng)興奮引起的氣管平滑肌收縮，該研究結(jié)果表明，地龍的平喘作用可能與膽堿能受體信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步研究了地龍平喘的活性成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)地龍與平喘作用相關(guān)的活性化合物56 個(gè)、作用靶點(diǎn)67個(gè)、相關(guān)通路15條，討論了脂肪酸、核苷酸、氨基酸和含氮分子等其他化合物調(diào)節(jié)AA 代謝過(guò)程、FcεRI 信號(hào)通路、膽堿能神經(jīng)突觸信號(hào)通路、色氨酸代謝通路與發(fā)揮平喘作用的關(guān)系，驗(yàn)證了地龍?zhí)崛∥飳?duì)膽堿能受體興奮造成的離體氣管平滑肌收縮的舒張作用，說(shuō)明地龍發(fā)揮平喘作用具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的特點(diǎn)。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡釋了地龍的活性成分、靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路和生物過(guò)程，為地龍平喘作用的藥效基礎(chǔ)研究提供了參考。