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    谷物β-葡聚糖測定方法研究進展

    2021-12-01 09:06:52李丹青張凱龍閆金婷胡新中閆喜梅
    麥類作物學報 2021年9期
    關(guān)鍵詞:酶法葡聚糖谷物

    李丹青,張凱龍,閆金婷,胡新中,董 銳,閆喜梅

    (1.商洛學院,陜西商洛 726000;2.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西西安 710119;3.西安市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗監(jiān)測中心,陜西西安 710077)

    β-葡聚糖是由β-葡萄糖苷鍵連接D-葡萄糖而成的非淀粉多糖,在自然界中廣泛存在。其按結(jié)構(gòu)可分為β-1,3-葡聚糖、β-1,3-1,6-葡聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖,主要來源有谷物、細菌和真菌[1]。

    在眾多來源中,谷物β-葡聚糖由于其豐富、安全、可靠的來源以及優(yōu)良的理化特性成為研究焦點。谷物β-葡聚糖具有多種生理功能和作用。它可以調(diào)節(jié)血糖水平,預防二型糖尿病[2-4];降低血清膽固醇水平,預防心血管疾病[5-6];平衡腸道菌群,預防結(jié)腸癌[7-9];調(diào)節(jié)血壓[10]和增強免疫細胞活性[11]。此外,谷物β-葡聚糖還可作為添加劑應(yīng)用于乳制品、冰淇淋等食品生產(chǎn),改善這些產(chǎn)品的感官品質(zhì)[12-13]。

    當前,谷物β-葡聚糖的檢測方法主要依靠酶法[14]。此外,研究人員基于β-葡聚糖的特性還開發(fā)了熒光法[15]、粘度法[16]等方法。不同的檢測方法在成本、檢測結(jié)果準確度和檢測效率等方面存在差異,因此適用于不同的谷物產(chǎn)品或檢測需求。

    作為一種重要的膳食纖維,β-葡聚糖的檢測在谷物尤其是大麥和燕麥的育種、加工和產(chǎn)品開發(fā)等方面都被十分重視[17-18]。開發(fā)經(jīng)濟、快速、準確、可大批量檢測的方法已成為燕麥和大麥產(chǎn)業(yè)亟需解決的問題。本文綜述了當前谷物β-葡聚糖的檢測原理、相關(guān)方法和標準,以期為準確檢測谷物β-葡聚糖含量、開發(fā)特定檢測需求的方法等提供參考。

    1 谷物β-葡萄糖的結(jié)構(gòu)

    谷物β-葡聚糖來源廣、含量高、分子量大,是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維[19]。作為一種植物細胞壁成分,β-葡聚糖可以與熒光染料結(jié)合顯色,因此采用熒光染色技術(shù)可以觀察到它在谷物籽粒中的分布[20-22]。

    燕麥和大麥是最常見的谷物β-葡聚糖來源,小麥和黑麥中含有一定的β-葡聚糖[23]。與細菌和真菌β-葡聚糖不同,谷物β-葡聚糖由β-1,3鍵和β-1,4鍵混合連接而成,是一種線性多糖。其中,β-1,4鍵連接D-葡萄糖單體形成纖維糖單元,而β-1,3鍵再將這些纖維糖單元連接形成β-葡聚糖。β-1,3鍵的存在可以有效避免分子緊密堆積并且使其具有一定的水溶性,因此β-1,3與β-1,4鍵的比例、纖維三糖和纖維四糖的比例等因素會對β-葡聚糖的理化特性造成影響[23-24]。

    在不同的基因型和環(huán)境下,β-葡聚糖在谷物中的含量和結(jié)構(gòu)會有所差異(表1)。大麥和燕麥中β-葡聚糖的含量較高,分別占籽粒干重的 2.2%~8.8%和1.73%~5.70%;而小麥和黑麥中β-葡聚糖含量分別為0.38%~0.64%和 1.4%~2.6%[25-26]。此外,谷物β-葡聚糖分子內(nèi)纖維三糖和纖維四糖的比例、β-1,3鍵與β-1,4鍵的比例、分子量等會存在一定的差異。例如,燕麥β-葡聚糖的分子量較高,為180~850 kDa[27],而黑麥β-葡聚糖分子量僅為21 kDa[28]。這些差異主要歸因于谷物不同的基因型和生長環(huán)境。β-葡聚糖在結(jié)構(gòu)上的差異會使其具有不同的理化特性,如β-1,3與β-1,4鍵的比例與水溶性有關(guān),而β-葡聚糖的分子量與其溶液粘度有關(guān)。谷物β-葡聚糖溶液具有很高的粘度,是一種非牛頓流體,β-葡聚糖濃度、分子量越大,其溶液粘度越高[29]。β-葡聚糖還可以形成凝膠,目前控制其凝膠行為的因素尚不清楚,但一般認為凝膠速率與β-葡聚糖的分子量有關(guān)。除此以外,β-葡聚糖還可以吸水溶脹,β-葡聚糖上的羥基可以與水分子通過氫鍵作用結(jié)合,同時其分子內(nèi)的纖維三糖或纖維四糖可以被β-1,3鍵連接形成結(jié)合區(qū),從而有效地將水束縛其中[30]。

    表1 谷物β-葡聚糖化學結(jié)構(gòu)特性Table 1 Chemical structure properties of cereal β-glucan

    2 谷物β-葡聚糖的檢測原理

    目前谷物中β-葡聚糖含量有多種檢測方法,根據(jù)β-葡聚糖的性質(zhì),這些方法的原理可以概括為四種:將β-葡聚糖水解為葡萄糖單體;將β-葡聚糖與某種染料特異性結(jié)合;利用β-葡聚糖自身的物理特性;其他。

    2.1 水解為葡萄糖單體

    如前所述,燕麥β-葡聚糖是由β-1,3鍵和β-1,4鍵連接D-葡萄糖而成的線性多糖,直接定量β-葡聚糖并不容易,而將β-葡聚糖水解為D-葡萄糖單體,通過檢測葡萄糖單體的含量來定量β-葡聚糖就比較可行。通??刹捎蒙锼夥ê突瘜W水解法來水解β-葡聚糖。生物水解法需要選擇特定的專一性水解酶切斷β-1,3鍵和β-1,4鍵,使β-葡聚糖降解為葡萄糖單體[14];而化學法是采用一定濃度的酸溶液在特定溫度下將β-葡聚糖裂解為葡萄糖單體[33-34]。葡萄糖單體可以利用氧化酶法將其轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì),在波長510 nm下該物質(zhì)吸光度與葡萄糖含量成正比。此外,采用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)也可以檢測葡萄糖單體的含量。最后可通過葡萄糖含量定量得出β-葡聚糖的含量。

    2.2 與染料結(jié)合

    β-葡聚糖可以與特定物質(zhì)結(jié)合,結(jié)合物顏色或熒光強度會發(fā)生變化。這是谷物β-葡聚糖定量檢測的另一主要原理。如β-葡聚糖能與染料剛果紅結(jié)合,其結(jié)合機制可能是由于疏水作用,結(jié)合物溶液的吸光度發(fā)生改變。通過檢測波長550 nm處的吸光度變化可以得出β-葡聚糖的含量[35]。此外,β-葡聚糖還能和熒光增白劑Calcofluor結(jié)合,通過檢測結(jié)合物熒光強度的變化也可以定量檢測β-葡聚糖的含量[36],其具體結(jié)合機制目前尚不明確。

    2.3 β-葡聚糖自身物理特性

    β-葡聚糖可以增加溶液粘度,同時還具有很強的吸水性,利用這些物理特性可以檢測谷物中β-葡聚糖含量。對于同一種特定分子量的β-葡聚糖,其溶液粘度與濃度成正比,因此通過檢測溶液粘度可以檢測β-葡聚糖含量[16]。值得注意的是,β-葡聚糖的分子量也會影響溶液粘度,分子量越高,粘度越大,因此使用該原理檢測時還需注意分子量的影響。β-葡聚糖的強吸水性可以增大谷物體系的持水性,即β-葡聚糖含量越高,體系的持水量越大。根據(jù)這一原理,Niu等[37]利用溶劑保持能力開發(fā)了燕麥β-葡聚糖檢測的新方法。

    2.4 其 他

    除了上述原理外,β-葡聚糖檢測的原理還有光譜法、酶聯(lián)免疫吸附法等。光譜法是利用近紅外光譜技術(shù),β-葡聚糖中的某些化學鍵在近紅外光譜下會產(chǎn)生伸縮振動倍頻吸收,符合朗伯比爾定律,即吸收峰的強度和待測物的濃度成正比[38]。而酶聯(lián)免疫吸附法的原理是開發(fā)特異性單克隆抗體,將β-葡聚糖作為底物與其特異性結(jié)合,通過顯色反應(yīng)定量檢測β-葡聚糖含量[39]。

    3 谷物β-葡聚糖的檢測方法與相關(guān)標準

    β-葡聚糖在食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,并且具有重要的生理活性,在燕麥產(chǎn)業(yè)各個環(huán)節(jié)(育種、加工、產(chǎn)品開發(fā)等)都需要檢測β-葡聚糖含量。表2總結(jié)了目前各β-葡聚糖檢測方法原理、優(yōu)缺點以及相關(guān)標準。

    3.1 酶 法

    目前,酶法是β-葡聚糖最常用的檢測方法,已被開發(fā)成試劑盒成為經(jīng)典的商用檢測方法。該方法于1985年被McCleary[14]首次提出并改進,可用于檢測谷物及其制品中β-葡聚糖的含量。酶法是國際公認的β-葡聚糖檢測方法,已經(jīng)被美國分析化學家協(xié)會(AOAC International,995.16)[40]、美國谷物化學家協(xié)會(AACC,32-23.01)[41]等多個國際權(quán)威組織認證。該方法采用地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶水解(圖1),首先在沸水中使谷物或其制品的β-葡聚糖溶出,進而被地衣聚糖酶(lichenase)特異性水解為小分子寡糖,之后采用β-葡萄糖苷酶將其裂解為單個的葡萄糖分子,通過檢測葡萄糖的含量可以定量檢測β-葡聚糖,即使用葡萄糖過氧化酶緩沖液將葡萄糖轉(zhuǎn)換為有色物質(zhì),在波長510 nm處定量檢測其含量。該法檢測特異性強,不易被其他多糖干擾,檢測結(jié)果準確度高、穩(wěn)定,是使用最廣泛的β-葡聚糖檢測方法,但高純度專一性強的地衣聚糖酶和葡萄糖苷酶價格昂貴,檢測成本較高。

    圖1 谷物β-葡聚糖酶法檢測原理Fig.1 Principle of enzymatic quantitative analysis of cereal β-glucan

    為了減少樣本用量、節(jié)省試劑消耗量、節(jié)約檢測成本,Hu和Burton[42]對這一檢測方法進行了一定改進。他們采用96孔板法檢測了21個不同燕麥樣品的β-葡聚糖含量,將傳統(tǒng)的酶法檢測使用的地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶用量減少了25%,每個樣品檢測成本減少了22%,勞動力成本減少了25%。之后。Motilva等[43]使用微量法在Megazyme酶法檢測的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化,檢測了β-葡聚糖含量從0.27%到75%的樣品。傳統(tǒng)的Megazyme酶法在樣品被地衣聚糖酶水解后,需要加入0.1 mL β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖單體,并用3 mL GOPOD(葡萄糖過氧化酶緩沖液)試劑反應(yīng)顯色。而改進后的微量法只需要20 μL的β-葡萄糖苷酶和210 μL的GOPOD,經(jīng)t檢驗,其檢測結(jié)果與酶法無顯著差異。

    3.2 色譜法

    采用色譜技術(shù)可以檢測谷物β-葡聚糖含量,這是因為多糖在一定溫度的酸性條件下可以被降解為小分子物質(zhì)。酸溶液的濃度、溫度和水解時間等會影響水解效率,導致水解不徹底或破壞產(chǎn)物單糖的結(jié)構(gòu)。水解產(chǎn)物葡萄糖可通過氣相色譜(GC)或高效液相色譜法(HPLC)進一步分析。Johansson等[33]比較了三種酸溶液(HCl、TFA和H2SO)在不同酸濃度、溫度和水解時間下對β-葡聚糖的水解情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在最弱的酸性條件下(37 ℃,pH=1,模擬人胃液酸性條件),β-葡聚糖不會被水解;而三種酸溶液在120 ℃、持續(xù)1 h水解β-葡聚糖時得到了相同的葡萄糖含量。該方法檢測結(jié)果與酶法接近,準確度高,但需使用價格昂貴的色譜設(shè)備,并且前處理過程的實驗條件(高溫、強酸)具有較高的安全風險,這些因素在一定程度上限制了該方法的使用。

    3.3 剛果紅法

    剛果紅染料可以與β-葡聚糖結(jié)合形成復合物。剛果紅自身是一種紅色染料,在紫外可見光譜區(qū)具有吸光度。加入β-葡聚糖后,結(jié)合物在波長550 nm處的吸光度會隨著β-葡聚糖濃度的增加而改變。使用該方法檢測谷物β-葡聚糖含量時,需在一定濃度的剛果紅溶液中加入不同含量的標準β-葡聚糖,混合后建立β-葡聚糖濃度標準曲線,進而可測得樣品中β-葡聚糖含量[35]。該法中使用的剛果紅染料價格相對便宜,成本較低。但剛果紅與β-葡聚糖的結(jié)合并非特異性,當其應(yīng)用于谷物中時,易被其中的其他水溶性多糖如戊聚糖等造成干擾,影響測量結(jié)果,因此該法在準確度上有一定限制。

    3.4 熒光法

    熒光法也是常用的β-葡聚糖定量方法之一。這種方法是基于溶液熒光強度的改變實現(xiàn)的,即熒光劑Calcofluor和β-葡聚糖能特異性結(jié)合形成復合物,體系溶液的熒光強度與β-葡聚糖濃度有關(guān)?;诖嗽?,Jorgensen[44]在1988年設(shè)計了一種自動流動注射分析系統(tǒng),利用濕法分析化學技術(shù)將樣品溶液與熒光劑混合,來檢測樣品中β-葡聚糖的含量。該方法已廣泛應(yīng)用于啤酒、麥芽汁等液體樣品中β-葡聚糖的檢測。該法需將含β-葡聚糖的樣品稀釋成溶液,采用標準β-葡聚糖溶液建立濃度-熒光強度標準曲線,進而可得到樣品中β-葡聚糖含量。與傳統(tǒng)的酶法相比,熒光法檢測成本較低,同時其檢測結(jié)果與酶法呈顯著相關(guān),準確度較高。但是,熒光劑Calcofluor穩(wěn)定性較差,易光分解,而且谷物體系成分復雜,其中的蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)也會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。這些因素在一定程度上限制了它在谷物β-葡聚糖測定中的應(yīng)用。

    3.5 粘度法

    β-葡聚糖具有高粘度,溶液濃度越大,粘度越高。對于燕麥粉和大麥粉來說,其漿液的表觀粘度主要取決于β-葡聚糖的含量,而淀粉和蛋白質(zhì)只有很小的影響。Colleoni-Sirghie等[16]將燕麥粉分別加入到去離子水、硝酸銀溶液(抑制內(nèi)源性β-葡聚糖酶)和堿溶液(溶解水溶性和水不溶性β-葡聚糖),制得燕麥粉勻漿,研究勻漿液表觀粘度與β-葡聚糖含量的關(guān)系,并采用偏最小二乘法(PLS)預測了β-葡聚糖含量,結(jié)果顯示,利用硝酸銀溶液燕麥粉勻漿的表觀粘度可以很好地預測β-葡聚糖含量,其結(jié)果與酶法結(jié)果非常接近。粘度法測定原理簡單、成本低、操作簡便,然而β-葡聚糖溶液粘度還受分子量的影響,采用該法時需要使用分子量接近的樣品。因此,該方法可用于檢測同種分子量β-葡聚糖的含量,例如同種燕麥籽粒制得的不同產(chǎn)品中的β-葡聚糖含量。

    3.6 溶劑保持能力法

    溶劑保持能力(SRC)是指小麥粉在一定離心力作用下保持溶劑多少的能力,可以用來衡量小麥粉及其制品的品質(zhì)特性。其原理是小麥粉中聚合物分子如蛋白質(zhì)、淀粉、戊聚糖等在不同溶劑中可以產(chǎn)生不同程度的溶脹。SRC檢測可選用水、5%(w/w)乳酸水溶液、5%(w/w)碳酸鈉水溶液和50%(w/w)的蔗糖水溶液四種溶劑。這四種溶劑分別對應(yīng)小麥粉中不同聚合物組分,其中水SRC體現(xiàn)了面粉中所有聚合物組分的溶脹能力;乳酸SRC具有面團發(fā)酵過程中相似的pH值,因此與谷蛋白的溶脹能力有關(guān);碳酸鈉SRC溶液的pH值較高,能使淀粉羥基解離,破損淀粉在此溶液中能夠吸水膨脹,因此該SRC與破損淀粉含量有關(guān);蔗糖SRC溶液濃度高,并且呈中性,該溶液放大了阿拉伯木聚糖網(wǎng)絡(luò)的溶脹效果,因此與小麥戊聚糖含量有關(guān)[45]。β-葡聚糖是一種大分子聚合物,含有較多的羥基,吸水性強,β-1,3鍵連接的纖維糖單元能束縛水分子,因此具有很強的吸水溶脹能力。Niu等[37]首次將小麥SRC方法應(yīng)用于燕麥,研究了不同溶劑與燕麥溶脹特性之間的關(guān)系,從中篩選出能反映燕麥β-葡聚糖含量的氯化鈣溶劑。該方法檢測β-葡聚糖含量時,可直接將對應(yīng)溶劑(25 g)加入至5 g燕麥粉中,離心后通過檢測燕麥粉保持溶劑的重量預測β-葡聚糖含量,原理簡單,操作簡便。但是谷物體系中的其他大分子聚合物也會產(chǎn)生溶脹,當β-葡聚糖含量較低時不易被檢出,因此該方法的檢測準確度有待進一步優(yōu)化。使用該方法可以預測燕麥β-葡聚糖含量的大致區(qū)間,因此可用于育種等環(huán)節(jié)β-葡聚糖含量的初步篩選。此外,我們先前的研究結(jié)果還表明,燕麥粉SRC與β-葡聚糖的分子量也有顯著相關(guān)性[46],這也為β-葡聚糖分子量的快速檢測提供了一些思路。

    3.7 近紅外法

    近紅外光譜已被廣泛用于農(nóng)業(yè)、制藥、高分子制造和食品品質(zhì)檢測中。在近紅外光譜區(qū),分子中化學鍵(如C-H、N-H、O-H鍵)在特定波長具有特征峰,通過分析某物質(zhì)的光譜區(qū)單一或多種分子的倍頻峰可以檢測其組成成分。使用近紅外方法預測某種組分含量時,需首先采集樣本集的近紅外光譜并對原始光譜進行預處理,之后采用數(shù)學分析建立該組分的預測模型,最后對該模型檢驗并轉(zhuǎn)換應(yīng)用[47]。目前,國內(nèi)外已有一些研究報道了采用近紅外方法對谷物β-葡聚糖的檢測,這些研究使用的樣品主要是粉碎后的谷物粉。部分研究使用完整的谷物籽粒進行檢測,并且這些研究均以Megazyme酶法檢測結(jié)果作為參比值進行數(shù)學建模[48-54]。Schmidt等[38]評估了近紅外光譜法測定大麥中β-葡聚糖的方法的潛力,他們使用四種不同的近紅外儀器分析了107種大麥樣品(分別采用全籽粒和大麥粉),首先對光譜進行采集并對原始光譜進行預處理,采用偏最小二乘法(PLS)建立了大麥β-葡聚糖近紅外預測模型,結(jié)果表明,所有測試顯示出了對β-葡聚糖監(jiān)測有一定的適用性(R2>0.78)。該方法快速簡便,可以短時間內(nèi)檢測大批量樣品。需要注意的是,近紅外方法檢測結(jié)果的準確性受多種因素影響,包括樣本化學參比值的準確性、待測指標在樣本中的含量以及是否呈正態(tài)分布、高強度背景和譜峰重疊、樣本規(guī)模、選用的數(shù)學模型等。β-葡聚糖結(jié)構(gòu)單一,其分子內(nèi)化學鍵很容易與燕麥中其他組分(淀粉、蛋白質(zhì)等)發(fā)生重疊,影響準確性。該方法適用于樣本量較大時的檢測,然而在建立該方法時仍需大量已知化學參比值的樣本(樣本量一般需大于100)建立近紅外定量模型。

    3.8 酶聯(lián)免疫吸附法

    酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種常用的生化分析測定法。該方法使用特定抗體檢測液體樣品中配體的存在。ELISA也可應(yīng)用于谷物β-葡聚糖含量微量水平的測定。Rampitsch等[39]開發(fā)了不同的單克隆抗體,研究了他們與來自燕麥和大麥β-葡聚糖的反應(yīng)程度和特異性,使用ELISA對市售燕麥β-葡聚糖檢測,其結(jié)果在一定范圍內(nèi)呈線性(1~20 ng β-葡聚糖·mL-1)。此外他們優(yōu)化了ELISA實驗條件,并開發(fā)了一種能夠節(jié)約時間和勞動成本的樣品大批量檢測方法。理論上ELISA方法可以檢測納克水平上的β-葡聚糖,可以應(yīng)用于樣本量較少時的微量測試。然而由于該方法特異性極強、靈敏度高,可能不能識別具有相似結(jié)構(gòu)的所有β-葡聚糖,其適用性有待進一步研究。

    4 結(jié) 論

    谷物β-葡聚糖是一種重要的膳食纖維來源,在谷物尤其是燕麥和大麥的育種、加工等多個環(huán)節(jié)中都需要檢測β-葡聚糖的含量。在目前所開發(fā)出的谷物β-葡聚糖檢測方法中,酶法、色譜法、熒光法可用于準確定量β-葡聚糖含量。粘度法和溶劑保持能力法操作簡便,可用于β-葡聚糖含量初步篩選。近紅外方法檢測快速,可用于樣本量較多時的批量檢測。人們可綜合考慮準確度、操作效率、成本等因素合理選用符合自身需要的檢測方法。

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