小麥粒形QTL元分析及候選基因預(yù)測

王 鵬，田 甜，張沛沛，劉 媛，陳 濤，王彩香，程宏波，楊德龍

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

籽粒長度和寬度決定小麥(Triticumaestivum)種子的大小，進(jìn)而影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，是小麥育種中的重要農(nóng)藝性狀[1]。研究表明，小麥的粒長和粒寬是典型的數(shù)量性狀，由多基因控制，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受環(huán)境因素的影響[2]。目前，QTL定位是深入研究復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的有效方法之一，已廣泛應(yīng)用于作物農(nóng)藝性狀遺傳解析[3]。許多研究者利用不同遺傳背景材料和遺傳圖譜，對小麥粒長和粒寬進(jìn)行了QTL定位和遺傳分析。Ramya等[4]以Rye Selection 111×中國春構(gòu)建的RIL群體，檢測到8個控制粒長的QTL和15個控制粒寬的QTL，分布在1A、1D、2B、2D、4B、5A、5B和5D染色體上，單個QTL可解釋4.4%～11.5%的表型變異。Kumari等[5]以NW1014×HUW468構(gòu)建的RIL群體，在4A和5A染色體上檢測到2個控制粒長的QTL，在6A和7D染色體上檢測到2個控制粒寬的QTL，單個QTL可解釋7.66%～53.84%的表型變異。Xie等[6]以面包小麥×Spelt構(gòu)建的RIL群體，在1D、2A、3B、4A、5A和7B染色體上檢測到8個控制粒長的QTL；在2D和5A染色體上檢測到2個控制粒寬的QTL，單個QTL可解釋6.6%～31.8%的表型變異。然而，由于群體材料遺傳背景、統(tǒng)計(jì)方法、標(biāo)記類型和環(huán)境條件的不同，導(dǎo)致定位到的控制小麥粒長和粒寬的QTL數(shù)目、染色體位置和遺傳效應(yīng)差異較大，難以獲得真實(shí)、穩(wěn)定的QTL區(qū)段和位點(diǎn)，無法直接在育種實(shí)踐中應(yīng)用。因此，通過整合QTL，可提高小麥粒長和粒寬定位的精確度。

元分析是一種整合前人研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析方法，應(yīng)用于動、植物的QTL整合分析。Arcade等[7]開發(fā)出用于元分析的BioMercator軟件，該軟件可將目標(biāo)性狀相關(guān)的所有QTL位點(diǎn)映射整合在一張遺傳圖譜上，通過比對分析，預(yù)測一致性真實(shí)QTL位點(diǎn)，并可進(jìn)一步縮小置信區(qū)間，為精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。Semagn等[8]收集183個與玉米花期和產(chǎn)量相關(guān)的QTL位點(diǎn)進(jìn)行元分析，發(fā)現(xiàn)68個一致性QTL(meta quantitative trait loci,MQTL)。雷 蕾等[9]對344個水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL進(jìn)行元分析，最終獲得46個MQTL，共篩選出9個與耐鹽性狀相關(guān)的候選基因。江培順等[10]通過對584個控制玉米穗行數(shù)、行粒數(shù)、粒重相關(guān)的QTL進(jìn)行元分析，分別發(fā)現(xiàn)7、22和44個與行粒數(shù)、穗行數(shù)和粒重相關(guān)的MQTL，最終得到10個與玉米產(chǎn)量性狀相關(guān)的基因。本研究將已報(bào)道的控制小麥粒長和粒寬的QTL進(jìn)行歸納整理，以小麥高密度遺傳圖譜作為參考圖譜，利用BioMercator 4.2軟件將這些QTL映射到參考圖譜上，構(gòu)建小麥粒長和粒寬QTL一致性圖譜，并預(yù)測MQTL區(qū)間內(nèi)與小麥粒長和粒寬相關(guān)的候選基因，以期為深入研究小麥粒長粒寬的遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以美國農(nóng)業(yè)部小麥公共數(shù)據(jù)庫(http://wheat.pw.usda.gov/)和已發(fā)表的文獻(xiàn)中控制小麥籽粒長度和寬度的QTL信息[2-4,6,11-21]為研究對象。

1.2 方 法

1.2.1 小麥粒長和粒寬QTL信息的收集整合

收集已報(bào)道的控制小麥粒長和粒寬QTL定位信息，按照BioMercator 4.2軟件(https://www.mybiosoftware.com/biomercator-2-1-genetic-maps-qtl-integration.html)要求進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，包括QTL名稱、染色體位置、置信區(qū)間、連鎖系數(shù)、貢獻(xiàn)率、臨近標(biāo)記、LOD值和群體大小等，其中，QTL位置(置信區(qū)間和QTL的最大可能位置)和遺傳貢獻(xiàn)率是進(jìn)行QTL元分析的兩個必要參數(shù)。

1.2.2 小麥粒長和粒寬QTL映射

確定收集到的QTL所涉及的染色體，選取Wheat composite 2004(https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/report.cgi?class=mapdata;query=;name=Wheat,+Composite,+2004)高密度遺傳圖譜作為參考圖譜，將目標(biāo)QTL的位置信息按比例標(biāo)注到參考圖譜上，即QTL映射。將映射失敗的標(biāo)記先映射到Somers等[22]繪制的小麥整合圖譜(即中介圖譜)上，然后對共有分子標(biāo)記進(jìn)行映射，剔除有爭議的QTL。

1.2.3 小麥粒長和粒寬QTL元分析

利用BioMercator 4.2軟件將位于同一染色體相同位點(diǎn)附近的N個獨(dú)立存在的與小麥粒長和粒寬相關(guān)的QTL進(jìn)行運(yùn)算，對獨(dú)立來源的同一性狀且位于同一座位或重疊座位的QTL計(jì)算出一個MQTL。每個MQTL給出5個模型(1、2、3、4和N)，其中，赤池信息量準(zhǔn)則值(akaike-type criteria values,AIC)最小的模型為真實(shí)QTL模型，按照最大似然函數(shù)比方法通過高斯定理計(jì)算其置信區(qū)間及物理位置。若某一QTL置信區(qū)間未知，可通過Darvasi等[23]應(yīng)用的公式進(jìn)行推斷：

(1)C.I.=530/(N×R2)

(2)C.I.=163/(N×R2)

其中C.I.指QTL 95%的置信區(qū)間，N指作圖群體的大小，R2指QTL的遺傳貢獻(xiàn)率，F(xiàn)2和BC群體用公式(1)進(jìn)行計(jì)算，RIL、DH及NIL群體用公式(2)進(jìn)行計(jì)算。若已知QTL置信區(qū)間，也可根據(jù)此公式計(jì)算其遺傳貢獻(xiàn)率[24]。

1.2.4 基于小麥粒長和粒寬MQTL范圍內(nèi)候選基因的發(fā)掘

利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行目標(biāo)性狀QTL的整合，獲得粒長和粒寬MQTL區(qū)域，根據(jù)這些區(qū)域內(nèi)的EST或DNA序列搜索候選基因。該方法的原理為：物種內(nèi)及物種間存在序列同源性，基因的功能和序列緊密相關(guān)，當(dāng)序列的相似性超過一定的范圍時，它們執(zhí)行的功能可能相同，通過對比未知功能序列和已知功能序列，預(yù)測序列功能。

在參考圖譜Wheat composite 2004上，通過元分析所得的小麥粒長和粒寬MQTL區(qū)域由兩端標(biāo)記界定。對MQTL區(qū)間內(nèi)相關(guān)基因位點(diǎn)進(jìn)行整理，根據(jù)基因位點(diǎn)名稱，在GrainGenes (https://wheat.pw.usda.gov/)網(wǎng)站上下載相關(guān)基因序列和各種標(biāo)記的原始序列，從而確定MQTL在物理圖譜上的位置。利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(http://202.194.139.32/)中JBrowse工具檢索MQTL內(nèi)的基因信息，并獲得該區(qū)間內(nèi)所有基因的功能注釋信息，利用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)BLAST比對相關(guān)基因序列，預(yù)測目標(biāo)性狀候選基因[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 QTL信息收集和一致性圖譜整合結(jié)果

從表1可以看出，從小麥公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的文獻(xiàn)共收集到113個與粒長相關(guān)的QTL和86個與粒寬相關(guān)的QTL，它們來自于川35050×山農(nóng)483、大粒飽×BYL8、Rye Selection 112×中國春、面包小麥×Spelt、波蘭小麥×普通小麥、0911-46×42、Rye Selection 111×中國春、山農(nóng)0431×魯麥21、南大2149×望水白、西藏半野生Q1028×鄭麥9023、0911-14×42、G18-16×Langdon、6044×01-35、人工合成小麥SHW-L1×川麥32共14個不同遺傳背景的作圖群體。利用BioMercator 4.2軟件中的QTL projection功能將收集到的QTL映射到Wheat composite 2004小麥參考圖譜上。與粒長相關(guān)的QTL LOD值范圍為 2.00～12.90，遺傳貢獻(xiàn)率為0.04%～ 32.60%；與粒寬相關(guān)的QTL LOD值范圍為 2.00～8.57，遺傳貢獻(xiàn)率為 0.03%～40.79%。

表1 小麥粒長和粒寬QTL數(shù)據(jù)整合Table 1 Integration of QTL data for the kernel length and width in wheat

將收集到的原始圖譜上的QTL通過BioMercator 4.2軟件映射到參考圖譜Wheat composite 2004上，構(gòu)建小麥粒長和粒寬QTL一致性圖譜。結(jié)果(圖1)表明，與粒長、粒寬相關(guān)的QTL在各染色體上分布不均勻，部分QTL在同一染色體上成簇存在。如在2B、2D、3A、4B和5A染色體上各有1個QTL簇。這些QTL大都出現(xiàn)在一段區(qū)間內(nèi)，彼此之間有區(qū)間的重疊。其中，4B染色體上170.00 cM左右和5A染色體上85.00 cM左右各有3個QTL，說明該區(qū)間可能存在更為真實(shí)的QTL位點(diǎn)。

2.2 小麥粒長和粒寬QTL的元分析

利用BioMercator 4.2軟件中的Maps-analysis程序?qū)π←溋ｉL、粒寬QTL進(jìn)行元分析，以每次元分析中AIC值最小的模型為準(zhǔn)，確定1個真實(shí)QTL，最終得到18個控制粒長的MQTL，分別位于小麥的1A(4個)、2A(2個)、2B(3個)、2D(2個)、3A(1個)、4B(2個)、5A(1個)、5B(1個)、7A(1個)和7D(1個)染色體上，平均每條染色體上含有1.8個MQTL。根據(jù)其所在染色體的位置排列為MQTL1～MQTL18，其中，圖距小于3 cM的MQTL位點(diǎn)有2個，即MQTL5(0.57 cM)和MQTL6(2.80 cM)。MQTL7(118.48～125.73 cM)和MQTL8 (119.58～139.22 cM)置信區(qū)間存在很大的重合，推測此重疊區(qū)段可能存在控制小麥粒長的重要基因(表2)。

表2 小麥粒長QTL的元分析Table 2 Meta-analysis of QTLs for the kernel length in wheat

通過元分析得到了8個控制粒寬的MQTL，其中，2個MQTL定位在4B染色體上，3個MQTL定位在5A染色體上，在1A、3B和5B染色體上分別定位到1個MQTL。根據(jù)其所在染色體的位置排列為MQTL1～MQTL8，其中MQTL2和MQTL7圖距小于4.00 cM，分別為3.70 cM和3.60 cM(表3)。

表3 小麥粒寬QTL的元分析Table 3 Meta-analysis of QTL for the kernel width in wheat

2.3 小麥粒長、粒寬MQTL區(qū)間內(nèi)候選基因的預(yù)測結(jié)果

根據(jù)MQTL在物理圖譜上的位置，利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫所提供的基因注釋信息，預(yù)測小麥粒長和粒寬QTL定位區(qū)域內(nèi)的候選基因。由于選取較小的MQTL AIC值和圖距有利于提高QTL定位的準(zhǔn)確度，因此，將小麥粒長和粒寬QTL定位結(jié)果中AIC值和圖距均較小的MQTL進(jìn)行物理圖譜定位，統(tǒng)計(jì)MQTL區(qū)間內(nèi)所包含的基因個數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5A染色體上，控制粒長的MQTL15其側(cè)翼標(biāo)記為Xgwm293～Xgwm304，圖距為6.60 cM，包含28個基因；控制粒寬的MQTL7其側(cè)翼標(biāo)記為Xgpw2120～Xgpw2273a，遺傳距離為3.60 cM，包含82個基因。在這兩個MQTL區(qū)段進(jìn)行Jbrowse檢索，共篩選出22個候選基因(表4)。其中TraesCS5A01 G122300LC.1與小麥粒長相關(guān)，TraesCS5A01G-484900.1、TraesCS5A01G652600LC.1、Traes-CS5A01G652700LC.1、TraesCS5A01G487500.1、TraesCS5A01G651000LC.1、TraesCS5A01G651400LC.1共6個基因與小麥粒寬相關(guān)。它們通過編碼光系統(tǒng)CP43反應(yīng)中心蛋白、LEA蛋白、F-box蛋白、U-box蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與到小麥籽粒生長發(fā)育過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用和器官發(fā)育等途徑，進(jìn)而影響小麥粒長和粒寬，但具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

表4 小麥粒長和粒寬MQTL內(nèi)預(yù)測到的候選基因Table 4 Candidate genes within MQTL related to the kernel lenqth and width in wheat

染色體左側(cè)“點(diǎn)”至“橫線”表示QTL所在位點(diǎn)的遺傳貢獻(xiàn)率大小的連續(xù)變化；“豎線”表示QTL所在置信區(qū)間。The “dot”to “transverse line”on the left side of chromosome mean the successive change in the genetic contribution rate of QTL;“Vertical line”means the confidence interval of QTL.圖1 小麥粒長和粒寬QTL一致性圖譜Fig.1 Map of QTLs for the kernel length and width in wheat

3 討 論

高密度的遺傳圖譜可提高QTL映射的準(zhǔn)確性和高效性。本研究選取整合了11個標(biāo)準(zhǔn)圖譜的Wheat composite 2004作為參考圖譜，其主要包含AFLP、RFLP和SSR標(biāo)記，共涉及3 741個標(biāo)記，總長度為3 236 cM。此圖譜密度較大，但某些研究中原始圖譜與參考圖譜存在標(biāo)記一致性較差的問題，導(dǎo)致部分目標(biāo)性狀QTL不能直接映射成功。因此，本研究利用Somers等[22]繪制的小麥整合圖譜作為中介圖譜，該圖譜涉及到 1 234個SSR標(biāo)記，總長度為2 540 cM，與Wheat composite 2004參考圖譜存在大量共有標(biāo)記，可以提高映射效果，縮短兩標(biāo)記距離，為精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。

元分析技術(shù)可以對不同研究中定位的QTL進(jìn)行比較整合，縮小其置信區(qū)間，提高QTL定位的精確性。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于多種作物目標(biāo)性狀QTL的遺傳改良。吉海蓮等[26]收集了22個抗玉米黑穗病QTL，發(fā)掘出2個抗病MQTL區(qū)間，并在其中初步確定1個抗病基因；楊鑫雷等[27]構(gòu)建了含63個棉花纖維品質(zhì)性狀QTL的整合圖譜，在12條染色體上獲得15個相關(guān)性狀的MQTL；李修平等[28]對43個作圖群體的207個水稻抽穗期QTL信息進(jìn)行整理，以Cornell 2001為參考圖譜，共獲得14個與水稻抽穗期相關(guān)的MQTL。利用元分析對小麥不同數(shù)量性狀進(jìn)行QTL整合的研究報(bào)道較少，王健維等[29]對控制小麥品質(zhì)相關(guān)性狀的585個QTL進(jìn)行元分析，得到264個MQTL，其中34個與吸水率相關(guān)，26個與面粉蛋白質(zhì)相關(guān)，84個與籽粒蛋白質(zhì)含量相關(guān)，52個與籽粒硬度相關(guān)，39個與沉降值相關(guān)，29個與濕面筋含量相關(guān)，最小的置信區(qū)間為0.04 cM，表明基于元分析的 QTL 圖譜整合及其在目標(biāo)性狀精細(xì)定位中具有重要應(yīng)用價(jià)值。本研究收集14個群體113個控制小麥粒長的QTL和86個控制小麥粒寬的QTL，構(gòu)建小麥粒長和粒寬QTL一致性圖譜。通過元分析得到18個粒長MQTL和8個粒寬MQTL，置信區(qū)間均縮短，其中最小可縮短至0.57 cM，減小了QTL定位的誤差。其中，本研究在5A染色體上Xgwm239～Xgwm304區(qū)間內(nèi)獲得的控制粒長的MQTL與王建維等[29]發(fā)現(xiàn)的控制小麥品質(zhì)的MQTL(P41/M49-76～Xwmc492)有重疊區(qū)段，說明這些位點(diǎn)的表達(dá)可能存在遺傳關(guān)聯(lián)，或存在“一因多效”現(xiàn)象。

QTL定位的準(zhǔn)確性和置信區(qū)間大小是定位和克隆目標(biāo)性狀相關(guān)候選基因的基礎(chǔ)，利用元分析的方法確定和縮小置信區(qū)間，能夠有效提高候選基因克隆效率。隨著更多目標(biāo)性狀QTL的精細(xì)定位，借助生物信息學(xué)、模式作物的基因測序結(jié)果和比較基因組學(xué)方法，在MQTL區(qū)域內(nèi)可以得到更多DNA序列，這些序列具有較完整的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)同源對比，可以預(yù)測基因的功能，確定目標(biāo)性狀候選基因。本研究在控制小麥粒長和粒寬的MQTL內(nèi)初步確定了7個候選基因。其中，Traes CS5A01G484900.1編碼LEA蛋白，研究表明，LEA蛋白在植物種子脫水成熟過程中積累，調(diào)控種子含水量的降低速率，進(jìn)而影響種子形態(tài)[30]；TraesCS5A01G651000LC.1和TraesCS 5A01G651400LC.1編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可調(diào)節(jié)植物激素信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期蛋白的磷酸化狀態(tài)，最終影響種子形態(tài)[31]；TraesCS5A01G 652600LC.1和TraesCS5A01G652700LC.1編碼光系統(tǒng)CP43反應(yīng)中心蛋白，CP43是一種葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要參與太陽能的捕獲、激發(fā)能量向光化學(xué)反應(yīng)中心的有效轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)能量流動進(jìn)而影響種子形態(tài)形成[32]；TraesCS5A01G122300LC.1編碼U-box型泛素連接酶E3，參與蛋白降解、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)和形態(tài)發(fā)生等過程，從而影響植物的生長發(fā)育[33]；TraesCS5A01G487500.1編碼F-box蛋白，是組成E3泛素連接酶的成分，參與植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)育等過程[34]，Chen等[35]在水稻中發(fā)現(xiàn)了一個F-box基因OsFBK12，發(fā)現(xiàn)其可通過影響種子發(fā)育和籽粒灌漿調(diào)控種子大小。本研究通過對來自不同作圖群體的小麥粒長和粒寬QTL進(jìn)行整合，通過元分析方法獲得更為精確的MQTL，在相應(yīng)區(qū)段發(fā)掘候選基因，為小麥粒形QTL精細(xì)定位和基因圖位克隆奠定理論基礎(chǔ)，對小麥粒形分子標(biāo)記輔助選擇育種具有重要的意義。

4 結(jié) 論

借助小麥高密度遺傳圖譜，對199個來自不同遺傳作圖群體的控制小麥粒長(113)和粒寬(86)的QTL進(jìn)行元分析。建立一致性圖譜，共獲得18個控制粒長的MQTL和8個控制粒寬的MQTL，置信區(qū)間最短縮短至0.57 cM。在5A染色體上預(yù)測到7個與小麥粒長(1)和粒寬(6)相關(guān)的基因，但具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證，這為小麥粒形分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考依據(jù)。