缺氧誘導(dǎo)因子-1α 在骨折愈合中的作用*

田原野 康非吾

骨是血管化程度較高的組織,骨內(nèi)有豐富的血供來維持其營養(yǎng)和氧濃度，其血供大約占心排血量的10%，但由于閉合性骨折、炎癥、感染、腫瘤等許多局部或全身性因素可以造成骨組織內(nèi)血流中斷或減少,從而引發(fā)組織缺氧[1]。缺氧作為閉合性骨折后微環(huán)境改變的特征之一，其成因主要為供應(yīng)血管破損、正常的血液供應(yīng)受到阻斷、血液快速凝固成血凝塊或血腫[2]；骨創(chuàng)傷部位無法獲得足夠的氧氣以及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，逐步變成缺氧狀態(tài)[3]。如正頜手術(shù)LefortI 型截骨手術(shù)后鼻腭動脈、腭降動脈被切斷，廣泛的黏骨膜瓣切開翻起等使骨創(chuàng)傷區(qū)域氧分壓顯著降低至0～10mmHg，其骨折中心區(qū)氧分壓可降至0mmHg[4]。骨組織在缺氧下會產(chǎn)生一系列代償反應(yīng),如血流再分配、無氧代謝增加等以適應(yīng)缺氧微環(huán)境[5]，作為對局部氧環(huán)境進(jìn)行感受和應(yīng)答的核心分子，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α 在骨愈合過程中的骨生成、骨吸收以及骨內(nèi)血管的生成中均發(fā)揮著一定作用。

1.缺氧誘導(dǎo)因子-1α

1.1 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 的結(jié)構(gòu)及功能 人體有多種強大的機制來解決組織中缺氧狀態(tài)下氧氣利用率的降低；如(1)增加心輸出量和通氣量；(2)改善血管生成；(3)提高血液中氧氣的承載能力；(4)將有氧呼吸轉(zhuǎn)換為無氧呼吸。在細(xì)胞水平上，HIF轉(zhuǎn)錄因子家族驅(qū)動著骨組織內(nèi)細(xì)胞對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)[6]；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的分化和功能與缺氧誘導(dǎo)因子密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子家族包括3 種α 亞單位：HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α，這三種α 亞 單位通過與HIF-1β 組成異二聚體來發(fā)揮其調(diào)控作用[7]。其中HIF-1α 和HIF-2α 作為轉(zhuǎn)錄活性因子，主要與血管生成相關(guān)，但缺氧狀態(tài)下HIF-2α 的穩(wěn)定性不如HIF-1α；HIF-3α 則是具有負(fù)向調(diào)控作用的調(diào)節(jié)因子[8]，然而這兩種HIF 亞單位在骨折愈合過程中的作用尚缺乏深入研究。HIF-1α 包括4 個結(jié)構(gòu)域：其中C 端包括TAD-N 和TAD-C 兩個反式激活結(jié)構(gòu)；中間段為受氧依賴調(diào)控的降解結(jié)構(gòu)域ODDD；N 末端包括bHLH 域和PAS 域，這兩個結(jié)構(gòu)域主要與HIF-1β 的二聚化以及靶基因的結(jié)合有關(guān)[9]。在常氧條件下，ODDD 結(jié)構(gòu)域中的脯氨酸能夠被脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase,Phd)羥基化，被Phd 羥基化后能與Von Hippel-Lindau(VHL)連接；VHL 再將HIF-1α 進(jìn)行泛素化修飾，經(jīng)過泛素化修飾之后的HIF-1α 將被水解而失去功能[10]。氧分壓降低后，脯氨酸的羥基化作用受到抑制，使得HIF-1α 蛋白能與HIF-1β 形成二聚體，從而啟動其下游基因表達(dá)。此外HIF-1α 也可被一些金屬離子(如Mg2+、Ni2+、Cu2+等)、物理因素如超聲波和一些細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子和成纖維細(xì)胞生長因子等調(diào)節(jié)[11]。HIF-1α的下游靶基因約有100 多種，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促紅細(xì)胞生成素、血紅素氧合酶-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、內(nèi)皮素1、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，這些分子在調(diào)節(jié)組織內(nèi)氧的穩(wěn)態(tài)以及恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。

1.2 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 在骨內(nèi)的調(diào)控機制 現(xiàn)階段普遍認(rèn)為的缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)骨的代謝機制主要為HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路。HIF/VEGF 通路調(diào)控血管生成與骨的代謝主要涉及成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互信號傳遞：內(nèi)皮細(xì)胞分泌骨形成蛋白2 促進(jìn)骨形成，成骨細(xì)胞分泌VEGF增強血管生成[12]。在體內(nèi)實驗中，上調(diào)成骨細(xì)胞中的Phd、VHL 或HIF 可以增加VEGF 和血管生成[13]，敲除成熟成骨細(xì)胞中的HIF-1α 會等效地降低VEGF 的表達(dá)和血管體積，HIF-1α 高表達(dá)可以相應(yīng)地增加VEGF。在骨組織生物學(xué)中，Wnt 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生在骨形成過程中[14]，是進(jìn)行新骨沉積所必需的。已有體內(nèi)外實驗證實HIF-1α 與Wnt信號傳導(dǎo)之間的相關(guān)性，敲除HIF-1α 的小鼠能通過Wnt/ β-catenin 通路上調(diào)骨生成，而VHL和HIF-1α 能協(xié)同降低Wnt 信號傳導(dǎo)[15]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn):低氧或低氧模擬物會增加骨組織中的Wnt信號[16]，HIF-1α 與β-catenin 結(jié)合可以阻止Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄[17]。盡管這些研究確定了缺氧對Wnt信號的影響，但這也可能是成骨細(xì)胞的表觀遺傳修飾改變所造成的,因此尚需進(jìn)一步研究。

2.骨折愈合

骨折的愈合過程是斷端骨組織的修復(fù)再生反應(yīng),主要由骨生成相關(guān)的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞，骨吸收相關(guān)的破骨細(xì)胞和骨血管新生相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞共同參與。骨折愈合過程可分為：①血腫機化期②纖維骨痂形成期③骨性骨痂形成期。血腫機化期主要是骨折兩周以內(nèi)，局部因為骨折出血而形成血腫，然后引起無菌性的反應(yīng)，形成肉芽組織，并逐漸轉(zhuǎn)為纖維組織，HIF-1α 此時主要引起血管的生成。纖維骨痂形成期，骨內(nèi)膜及骨外膜形成內(nèi)、外的原始骨痂逐漸的鈣化、骨化，形成環(huán)狀骨痂及髓腔內(nèi)骨痂，HIF-1α 此時主要引起大量的成骨細(xì)胞在局部聚集，逐漸的形成骨痂。骨性骨痂形成期，在引力的作用下骨痂改造塑形，恢復(fù)骨的原形，此時HIF-1α 主要引起破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的偶連代謝。缺氧誘導(dǎo)因子-1α 在骨愈合過程中的主要通過與骨生成、骨吸收以及骨內(nèi)血管的關(guān)系來影響骨折愈合。

2.1 骨生成與缺氧誘導(dǎo)因子-1α 的關(guān)系 HIF-1α 驅(qū)動的信號主要通過成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境來調(diào)節(jié)及參與骨組織的形成。HIF-1α 可以促進(jìn)BMSCs 的聚集和骨發(fā)育，通過增加Sox9 基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)軟骨生成[18]。在軟骨細(xì)胞內(nèi)敲除HIF-1α 上游的Phd2 或Vhl 的小鼠中[19]，其軟骨分化能力增強，二次骨形成的量增加，這可能是由于肥大軟骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化所以產(chǎn)生了骨量升高的表型。骨祖細(xì)胞中Phd1/ 2/ 3基因的個別缺失未能產(chǎn)生骨骼表型，而Phd1/ 2/ 3基因的聯(lián)合缺失增加了靶基因HIF-1α 表達(dá)，血管生成增加、骨小梁密度及微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[13]。在敲除Phd2 的前成骨細(xì)胞或敲除HIF-1α 的成熟成骨細(xì)胞中觀察到骨骼的發(fā)育畸形或骨密度降低的現(xiàn)象[20]。成熟成骨細(xì)胞中的VHL 缺失會導(dǎo)致骨密度升高的表型，可能與增加的血管密度以及成骨速率增加有關(guān)。骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α 缺失的小鼠在表型上與野生型對照相似,而敲除骨細(xì)胞中Phd2 或Vhl 會使小鼠骨組織中骨量升高[21]。

骨折后缺氧環(huán)境中的HIF-1α 將招募BMSCs，并上調(diào)其向成骨細(xì)胞方向的分化能力[22]。軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生的HIF-1α 能刺激纖維骨痂內(nèi)的血管新生和軟骨基質(zhì)分泌[23]。在骨折愈合過程中如果出現(xiàn)血管形成異常，成骨細(xì)胞將不能正常替代軟骨細(xì)胞，從而影響軟骨基質(zhì)向骨基質(zhì)的礦化，骨組織無法正常愈合[24]。HIF/ VEGF 通路主要經(jīng)由血管生成來影響骨的愈合，也能促進(jìn)BMSCs 的增殖和遷移，缺氧預(yù)處理能夠抑制BMSCs 的凋亡，維持BMSCs 的干性[25]。而HIF/ Wnt 通路主要能夠調(diào)控BMSCs向成軟骨方向分化，抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其成骨能力[26]。骨細(xì)胞在缺氧環(huán)境下高表達(dá)HIF-1α[27]，并通過JNK 通路上調(diào)核因子受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)的分泌，誘導(dǎo)破骨向分化，影響骨的代謝。這些研究結(jié)果提示，HIF-1α 可以通過調(diào)節(jié)骨生成相關(guān)細(xì)胞來調(diào)節(jié)骨愈合中的骨生成過程。

2.2 骨吸收與缺氧誘導(dǎo)因子-1α 的關(guān)系 破骨細(xì)胞在骨吸收和骨重塑中起作用，其功能異常會引起許多骨骼疾病[28]。破骨細(xì)胞由髓樣造血干細(xì)胞融合而成，最主要的調(diào)控因子為巨噬細(xì)胞集落刺激因子(myeloid colony-stimulating factors,M-CSF)及RANKL，在兩者作用下髓樣單核細(xì)胞附著于骨表面逐漸分化成熟，表達(dá)組織蛋白酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等，進(jìn)而行使骨吸收功能[29]。成熟的破骨細(xì)胞在行使骨吸收功能時，細(xì)胞骨架重排，裙皺緣上的質(zhì)子泵分泌帶H+的酸來降解骨組織[30]。破骨細(xì)胞由血氧濃度飽和的骨髓中發(fā)育而來，逐漸逆氧濃度梯度，在氧分壓較低的骨表面或者骨折斷端逐漸分化成熟。隨著氧分壓的逐步降低,抗酒石酸鹽染色陽性的多核巨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而且骨吸收陷窩也相對增多,在氧分壓達(dá)到2%～5%時，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成熟達(dá)到最大值，能融合成比常氧狀態(tài)下體積更大，細(xì)胞核數(shù)量更多的破骨細(xì)胞[31]。缺氧狀態(tài)下破骨細(xì)胞分化成熟和骨吸收能力的增強可能與破骨細(xì)胞體積的增加、核數(shù)量增多、基因及蛋白表達(dá)量升高有關(guān)。缺氧可以改變細(xì)胞外酸性環(huán)境，缺氧組織中的無氧呼吸所產(chǎn)生的酸也能與缺氧相互協(xié)同作用[32],共同促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，影響骨的吸收。

在骨折愈合時，HIF-1α 所募集的破骨細(xì)胞啟動骨痂的重塑，纖維骨痂逐漸被編織骨替代[33]，加快骨痂吸收和重塑可在一定程度上促進(jìn)骨折愈合。激活HIF-1α 既能增加破骨細(xì)胞的數(shù)量又能增加其活性，使破骨細(xì)胞分泌更多的基質(zhì)金屬蛋白酶和組織蛋白酶等，提高破骨細(xì)胞在吸收死骨和骨重塑的效率。骨的吸收是一個耗能過程，HIF-1α 的表達(dá)能夠通過增加葡萄糖和谷氨酰胺載體的轉(zhuǎn)錄、增加糖酵解和谷氨酰胺的分解并產(chǎn)生ATP[34]，這也可能是HIF-1α 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性的機制之一。此外，HIF-1α 能夠上調(diào)趨化因子及其受體的表達(dá)，趨化因子及其受體可以促進(jìn)骨祖細(xì)胞與破骨細(xì)胞的募集、維持骨祖細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的黏附作用及生理穩(wěn)態(tài)[35]。以上研究提示，骨折修復(fù)過程中，HIF-1α 和相關(guān)因子將募集破骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的骨吸收能力，起到調(diào)節(jié)骨折愈合的作用。

2.3 骨內(nèi)血管生成與缺氧誘導(dǎo)因子-1α 的關(guān)系 骨折部位的機械刺激、炎癥信號以及由于氧和營養(yǎng)的供應(yīng)被中斷所導(dǎo)致的缺氧環(huán)境將啟動骨的修復(fù)，當(dāng)血管形成異常，骨組織將無法正常愈合，出現(xiàn)骨不連、骨壞死、骨折愈合延遲等情況[36]。氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)的中斷可以使HIF-1α 蓄積，這對刺激血管和新骨形成有重要意義。在骨折的早期階段，HIF-1α 在骨折斷端表達(dá)升高，骨折10d 達(dá)到峰值。牽張成骨模型中，骨切開后HIF-1α/ VEGF被激活，VEGF 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化，維持骨痂內(nèi)的血氧供應(yīng)，保障骨愈合的正常進(jìn)行[37]；在骨的牽張期間上調(diào)HIF-1α 能刺激更多的血管和新骨形成，血管和骨質(zhì)密度明顯升高；而在特異性HIF-1α 基因敲除鼠中，牽張成骨的部位血管數(shù)量減少、骨密度降低，出現(xiàn)編織骨無法正常替代纖維骨痂，出現(xiàn)骨折愈合延遲[38-39]。利用缺氧模擬物(去鐵胺)能夠抑制脯氨酸羥化酶，從而阻止脯氨酸羥化酶對HIF 的降解，使HIF-1α 蓄積激活缺氧相關(guān)通路，可以有效地刺激新生血管形成提高牽張成骨中的骨質(zhì)密度[40]。以上研究提示，骨折愈合時HIF-1α 通過刺激VEGF 來調(diào)控骨內(nèi)血管的生成，保證新生骨的血氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，保障骨愈合正常進(jìn)行。

3.結(jié)語

迄今的大量研究已經(jīng)證明骨組織中的缺氧信號對于骨折的修復(fù)至關(guān)重要；HIF-1α 可以影響骨內(nèi)的成骨相關(guān)細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及骨內(nèi)的血管生成，HIF-1α 相關(guān)信號通路的異常會導(dǎo)致骨折的愈合障礙。雖然骨折的愈合是一個緩慢而復(fù)雜的過程，但是有望通過藥理學(xué)手段調(diào)控HIF/ VEGF 通路及HIF/ Wnt 通路改變骨折愈合進(jìn)程，加速骨折修復(fù)。總之,在骨折的愈合過程中，缺氧誘導(dǎo)因子起到了一定的作用，調(diào)節(jié)骨折內(nèi)的缺氧代謝環(huán)境或缺氧誘導(dǎo)因子有望成為一種新的促進(jìn)骨折愈合的方法。