腫瘤干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

李聰 徐兵河

作者單位：100021 北京 國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院

目前惡性腫瘤患者5年生存率大幅提高，這與早篩選、早診斷、早治療以及新型治療手段的出現(xiàn)密切相關(guān)［1］。但也仍有部分患者會發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，甚至在多次治療后出現(xiàn)治療耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗。既往研究證實這些現(xiàn)象的產(chǎn)生與腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）的存在密切相關(guān)。CSCs最初是在乳腺癌和白血病中發(fā)現(xiàn)，它們是腫瘤組織內(nèi)的一小部分具有逆分化、自我更新能力的細(xì)胞，具有潛在的遷徙和轉(zhuǎn)移細(xì)胞特征，且對傳統(tǒng)化療和放療均耐藥。因此，針對難治性癌細(xì)胞的后續(xù)化療大多預(yù)后較差［2］。此外，研究表明CSCs可以分別從遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)途徑上通過細(xì)胞的內(nèi)外分子調(diào)控CSCs異質(zhì)性，其中mRNA也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在乳腺癌研究中顯示，mRNA-200c/141通過上調(diào)蛋白激酶1，激活β-catenin而調(diào)節(jié)CSCs異質(zhì)性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，是腫瘤細(xì)胞存活及逃逸的重要原因。CSCs通過表觀遺傳學(xué)修飾改變代謝途徑和表型特征也是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥的重要原因［3-4］。這些特征及其臨床意義都表明了研究CSCs的重要性。目前也已開發(fā)不少靶向CSCs的治療手段，但是由于缺乏特異性的靶向生物標(biāo)志物，治療效果仍然不理想。本文概述了CSCs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要作用，以及對臨床診斷及預(yù)后的影響及其靶向治療的研究新進(jìn)展，為進(jìn)一步探索CSCs潛在治療靶點提供線索。

1 CSCs的特征

1.1 CSCs基因及轉(zhuǎn)錄特征

干細(xì)胞是能夠自我更新的多能細(xì)胞，并具有分化成任何細(xì)胞類型的潛力，其主要代表為胚胎干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是器官中存在的少量未分化的干細(xì)胞。在正常細(xì)胞更新或損傷時，成體干細(xì)胞便可增殖分化補(bǔ)充受損細(xì)胞。CSCs可由正常干細(xì)胞經(jīng)過基因突變累積，增殖分化能力失去控制而產(chǎn)生。在腫瘤發(fā)生過程中常常累積許多突變，而最初的致癌突變可能發(fā)生在干細(xì)胞中。一項關(guān)于急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者的單細(xì)胞測序研究顯示，在正常造血干細(xì)胞中通常攜帶有一種或兩種突變，并同時存在于AML原始細(xì)胞中［5］。且在這些細(xì)胞中可出現(xiàn)幾種關(guān)鍵的突變組合，激活自我更新程序或使衰老和凋亡程序失活，從而賦予早期祖細(xì)胞永久的增殖能力［6］。其中，激活自我更新程序包括在多種腫瘤類型中激活的端粒酶（TERT）啟動子和AML中的表觀遺傳調(diào)控因子TAL1啟動子［7］。衰老和凋亡程序失活包括腫瘤抑制基因突變，如Tp53和CDKN2a.45-47，這些賦予細(xì)胞不受控制的增殖和擴(kuò)增特性［8］。這些突變還可發(fā)生在干細(xì)胞調(diào)控相關(guān)基因中，如 IDH1/2、DNMT3a/b和TET2等［9］。此外，這些基因突變最終都將通過直接或間接上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，包括OCT4、SOX2、KLF4、NANOG 和 c-MYC 等。以上干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)，與CSCs干性維持、自我更新、藥物抵抗、免疫逃避及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。

1.2 CSCs表觀遺傳學(xué)特征

染色質(zhì)是由DNA和組蛋白組成的多聚鏈，是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制。在CSCs中，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)可以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。目前研究表明，染色質(zhì)的組裝密度與耐藥性腫瘤細(xì)胞存活有關(guān)［10］。有研究顯示，染色質(zhì)可通過H3K27me3和H3K4me3分子調(diào)節(jié)染色質(zhì)組裝密度，調(diào)控基因表達(dá)水平，針對這兩個靶點的藥物聯(lián)合化療藥物應(yīng)用可根除不同類型腫瘤細(xì)胞［11］。近年也有研究表明上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）細(xì)胞受表觀遺傳機(jī)制調(diào)控［11］。最近一項研究報道EMT的主轉(zhuǎn)錄因子TWIST對腫瘤起始、轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)CSCs形成至關(guān)重要［12］。此外，受端粒酶活性控制的端粒重復(fù)序列決定細(xì)胞增殖分裂能力，然而在CSCs中，由于端粒酶活性過表達(dá)，染色體長度不穩(wěn)定，因此一定程度上賦予了CSCs自我更新能力。線粒體端粒酶活性還可通過降低ROS水平保護(hù)核DNA，從而產(chǎn)生抵抗治療的CSCs［13］。而有研究報道hTERT基因中發(fā)生的突變可調(diào)節(jié)端粒酶活性，因此靶向端粒酶和hTERT基因有望成為根治腫瘤的方式之一［14］。除了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重組，DNA去甲基化也是CSCs過度增殖分化，自我更新的機(jī)制之一。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A突變存在于20%的AML患者中，甲基化酶的共因子異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變存在于大多數(shù)膠質(zhì)瘤患者中［15］。IDH突變可以重新編程細(xì)胞功能并促進(jìn)自我更新能力的獲得。在正常的人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中，IDH1R132H過表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)干細(xì)胞特性的獲得。因此，CSCs可通過染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)重塑和DNA甲基化修飾等表觀遺傳學(xué)方式獲得自我更新，過度增殖等功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

1.3 CSCs生物標(biāo)志物

CSCs中存在特異性上調(diào)、下調(diào)、突變或者缺失的蛋白質(zhì)或糖蛋白，這對CSCs檢測和定位至關(guān)重要，也是作為生物標(biāo)志物的重要條件。這些蛋白質(zhì)與糖蛋白有的是細(xì)胞表面抗原，也有的存在于細(xì)胞質(zhì)中，如位于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性蛋白質(zhì)醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase，ALDH1）的活性增強(qiáng)與CSCs生物學(xué)特征相關(guān)［16］。目前CSCs生物標(biāo)志物檢測過程中主要面臨的問題是特異性不高，因此使用多種標(biāo)志物共同識別CSCs更可靠。大部分研究中常用細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測腫瘤中的 CSCs［17-19］，例如乳腺癌中的 CD44、CD24、CD133、ALDH1，結(jié)直腸癌中的 CD29、CD166、CD133、EpCAM 等，腦癌中的 CD90、CD133、CD15，皮膚癌中的CD20、CD271 等，肝癌中的 CD44、CD90、CD13 等，肺癌中的 CD44、CD133、CD166 等。

在CSCs形成過程中，通常是在錯誤的時間和位置上重新激活了在早期胚胎發(fā)生過程中活躍的信號通路［20］。目前已知的調(diào)控細(xì)胞干性特征的信號通路主要有 6 條，包 括 Hedgehog、JAK/STAT、Nanog、Notch、PI3K/AKT 和 Wnt/β-catenin 通路［21-24］。這些信號通路的激活使CSCs具有更強(qiáng)的增殖、遷移能力，并介導(dǎo)原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤生長。同時，這些信號通路相關(guān)的調(diào)控分子也成為CSCs特異性生物標(biāo)志物。此外，對CSCs保持自我更新能力的重要轉(zhuǎn)錄因子，如SOX2、NANOG、OCT4、KLF4和 c-MYC 也是潛在的靶點［25-26］。還有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣癌中的CD55信號傳導(dǎo)（衰變加速因子）可以調(diào)節(jié)自我更新和介導(dǎo)耐藥，且基本的多能轉(zhuǎn)錄因子NANOG、SOX2和OCT4等均受CD55調(diào)控，這些因子是CSCs維持的重要因素，也有潛力作為CSCs生物標(biāo)志物或治療靶點［27］。

1.4 CSCs微環(huán)境特征

復(fù)雜的局部腫瘤微環(huán)境是CSCs形成和維持的重要因素，包括間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）和免疫細(xì)胞［包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、可調(diào)節(jié) T 細(xì)胞（T cells regulatory，Tregs）、髓樣抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）和 T 輔助細(xì)胞 17（T help cell 17，Th17）］［28］。一方面，CSCs可通過這些基質(zhì)細(xì)胞相互作用，重塑腫瘤微環(huán)境，有利于CSCs的形成與維持。另一方面，這些基質(zhì)細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子和生長因子，刺激CSCs的自我更新與增殖分化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和免疫抑制［29］。例如，CSCs通過分泌HGF和CCL2，促進(jìn)纖維母細(xì)胞分化為CAFs，而CAFs可通過分泌纖維膠原蛋白，為CSCs提供機(jī)械支持，分泌細(xì)胞因子CXCL12和生長因子（肝細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究報道CAFs也參與相關(guān)的EMT過程，通過分泌TGFβ1促進(jìn)CSCs異質(zhì)性形成，是浸潤和轉(zhuǎn)移過程的早期步驟［30］。

2 CSCs在臨床治療和預(yù)后中的作用

2.1 CSCs誘導(dǎo)腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)

CSCs一個顯著的特點是能抵抗傳統(tǒng)化療和放療。常見的耐藥機(jī)制包括ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)增加、低活性氧（reactive oxygen species，ROS）狀態(tài)、抗凋亡途徑激活和DNA修復(fù)系統(tǒng)激活等［31］。放療和化療主要通過增加ROS水平殺死腫瘤細(xì)胞，然而CSCs可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而保護(hù)自身免受電離輻射和化療藥物的殺傷。研究顯示，KEAP1-NRF2途徑是ROS的主要調(diào)節(jié)劑，肺癌中該途徑的突變可使細(xì)胞對ROS具有抵抗力，因此大多數(shù)伴KEAP1-NRF2突變的Ⅱ期或Ⅲ期肺癌患者放療后會復(fù)發(fā)［32］?；熕幬镆钥焖俜至鸭?xì)胞為靶點，然而CSCs在化療期間可處于生長周期靜止或者休眠狀態(tài)，因此化療藥物無法殺傷這部分腫瘤細(xì)胞［33］。同時，化療藥物造成局部腫瘤微環(huán)境的改變還會進(jìn)一步刺激CSC內(nèi)信號通路激活，使之適應(yīng)局部微環(huán)境，從而致使腫瘤復(fù)發(fā)與惡化［18］。此外，這些由CSCs重建而來的腫瘤組織包含了更高比例的耐藥性CSCs，因此具有更強(qiáng)的放化療抵抗能力。還有研究顯示，放療可通過激活TGF-β信號通路誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，放射線照射癌細(xì)胞可增加EMT相關(guān)基因（如SNAIL和TWIST）表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞更具侵襲性且對治療產(chǎn)生抵抗［26］。

2.2 CSCs相關(guān)生物標(biāo)志物與臨床預(yù)后

近年來，大量研究數(shù)據(jù)顯示腫瘤組織中CSCs的存在與患者預(yù)后密切相關(guān)。目前大多數(shù)研究表明CSCs生物標(biāo)志物高表達(dá)可導(dǎo)致患者不良預(yù)后，主要表現(xiàn)為縮短的總生存期（overall survival，OS）［34］或無病生存期（disease-free survival，DFS）。在乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌中，CD133表達(dá)上調(diào)的患者預(yù)后較差［35］。ALDH1的表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、卵巢癌和乳腺癌中均與不良結(jié)局相關(guān)［34］。盡管CSCs生物標(biāo)志物在腫瘤診斷以及預(yù)后評估中具有重要的參考價值，但目前尚未發(fā)現(xiàn)適用于所有腫瘤類型的CSCs生物標(biāo)志物。例如，在肺癌和結(jié)直腸癌中，CD44表達(dá)與患者OS無明顯相關(guān)性，但在乳腺癌和胃癌中其與較差的生存結(jié)局高度相關(guān)［36-39］。也有研究顯示CSCs標(biāo)志物表達(dá)與腫瘤進(jìn)程無明顯相關(guān)性，但與較好的預(yù)后相關(guān)，這種矛盾的研究結(jié)果的產(chǎn)生可能與多種因素有關(guān)。例如，生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可能與癌癥進(jìn)展階段相關(guān)，有研究顯示，ALDH1表達(dá)水平與FIGO分期以及黏液癌組織學(xué)分型密切相關(guān)［40-41］。CSCs生物標(biāo)志物的表達(dá)還可能與疾病狀態(tài)和治療階段相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)在雌激素受體陰性（ER-）乳腺癌中，ALDH1表達(dá)水平與OS和DFS密切相關(guān)，ALDH1表達(dá)升高的患者預(yù)后更差，更早出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［42］。然而，在人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性的原發(fā)性乳腺癌中，ALDH1表達(dá)水平與OS和DFS無關(guān)［43-44］。因此認(rèn)為，采用多種生物標(biāo)志物組合進(jìn)行預(yù)測分析更具有可靠性。在乳腺癌中CD44+/CD24-組合預(yù)測患者預(yù)后的結(jié)果更具準(zhǔn)確性和一致性，多項研究也發(fā)現(xiàn)該表型乳腺癌與較差的OS、DFS和PFS相關(guān)［45-46］。對這些生物標(biāo)志物進(jìn)一步的組合分析發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-、ALDH1A1、ALDH1A3、integrinα6、CD133、EpCAM 和Ki-67的不同組合結(jié)果，在不同表型不同階段的腫瘤中預(yù)后結(jié)果也不同［47-48］。

3 CSCs靶向治療

CSCs對傳統(tǒng)化療和放療均呈抵抗?fàn)顟B(tài)，因此特異性針對CSCs的靶向治療成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點之一。目前已有多種CSCs相關(guān)靶向藥物處于研究中，其中Vismodegib和Sonedegib是已經(jīng)FDA批準(zhǔn)的靶向CSCs內(nèi)相關(guān)信號通路的藥物，兩者均可抑制Smoothened，從而抑制基底細(xì)胞癌中的Hedgehog信號通路［49］。另一種靶向治療藥物Duvelisib為PI3K-δ和PI3K-γ雙抑制劑，其中PI3K-δ參與白血病和淋巴瘤細(xì)胞的存活和增殖，而PI3K-γ則有助于細(xì)胞分化和遷移［50-51］。Duvelisib適用于治療復(fù)發(fā)性或耐藥性慢性淋巴細(xì)胞白血病或小淋巴細(xì)胞淋巴瘤患者。雖然這些已批準(zhǔn)的藥物均未定義為CSCs靶向藥物，但是這些藥物靶點在CSC內(nèi)信號通路激活中具有關(guān)鍵作用，也表明其對CSCs存在潛在的抑制功能。Palbociclib是第一種經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療癌癥的CDK4/6抑制劑，特別是激素受體陽性和HER2陰性乳腺癌，Palbociclib可抑制其CSCs自我更新［52］。Reparixin是一種主要用于治療胰腺移植患者的輔助藥物，但體外和小鼠腫瘤模型研究中已證實其具有殺死CSCs的能力［53］。

目前也有不少靶向CSCs的藥物在臨床試驗中失敗，其中很重要的一個原因是未能正確識別不同狀態(tài)下的CSCs。在增殖期和靜止期的干細(xì)胞中激活的信號通路可能不同，如在皮膚和其他組織中，存在靜止期和增殖期干細(xì)胞。增殖的干細(xì)胞依賴于Wnt信號傳導(dǎo)，但靜止的干細(xì)胞并不依賴于Wnt信號［54］。因此，針對Wnt信號的靶向藥物可能會消除增殖的干細(xì)胞，但不會消除靜止的干細(xì)胞。治療失敗的另一個主要原因是這些靶向藥物同時靶向正常干細(xì)胞和CSCs，如靶向基因方法（例如癌基因MYC）中針對以組蛋白乙?；˙ET途徑）的表觀遺傳調(diào)控BET家族為靶點藥物［55］。因此，在某些情況下，最大有效劑量的BET途徑抑制劑可能對正常腸道干細(xì)胞和CSCs具有同等毒性，導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道毒性。CSCs靶向治療的效果與傳統(tǒng)治療也不同，如絕大多數(shù)的普通腫瘤細(xì)胞不會立即減少。因此，為了達(dá)到更好的治療效果，CSCs靶向治療需與其他傳統(tǒng)腫瘤治療方法（如手術(shù)、化療和放療）結(jié)合。在理想情況下，腫瘤患者應(yīng)盡早使用CSCs靶向治療，因為早期CSCs細(xì)胞數(shù)量較少且CSCs內(nèi)的耐藥相關(guān)信號通路未被激活。此外，抗CSCs治療也可作為維持治療，有助于防止腫瘤復(fù)發(fā)，延長生存期。同時，由于CSCs在很大程度上受免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)，例如造血干細(xì)胞及其他干細(xì)胞通過表達(dá)CD47逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用。一項關(guān)于耐藥性非霍奇金淋巴瘤患者的研究中，CD47的抑制性抗體可恢復(fù)50%的患者對利妥昔單抗的敏感性，且有36%的患者達(dá)到完全緩解［56］。因此，將CSCs靶向治療與免疫激活治療相結(jié)合有可能成為徹底根除癌癥的新方法。

4 小結(jié)

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CSCs是導(dǎo)致腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要因素。CSCs主要起源于原始細(xì)胞的基因突變累積，自我更新程序激活，衰老和凋亡程序失活。表觀遺傳學(xué)調(diào)控不僅是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性形成的重要原因，也是CSCs改變代謝途徑和細(xì)胞表型獲得自我更新能力和耐受低氧低營養(yǎng)微環(huán)境的重要途徑之一。腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞間通過細(xì)胞因子相互作用，共同為CSCs的維持提供有利環(huán)境?；贑SCs特殊的生物學(xué)特征，臨床上可利用相關(guān)生物標(biāo)志物的特異表達(dá)進(jìn)行CSCs檢測和定位，為臨床診斷和預(yù)后分析提供有效依據(jù)。CSCs生物標(biāo)志物的表達(dá)往往與臨床病理特征密切相關(guān)，包括腫瘤低分化組織類型、TNM分期增加、血管浸潤、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。從目前生物標(biāo)志物的預(yù)測效果來看，今后還需要探索更準(zhǔn)確、更具一致性的生物標(biāo)志物以及其他類型的CSCs篩選方式。處于緩慢增殖期或休眠期的CSCs是腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)的重要因素，因此靶向CSCs治療是根治腫瘤的潛在希望。

隨著CSCs相關(guān)生物學(xué)研究的深入，其臨床轉(zhuǎn)化研究前景廣闊，但尚處于起步階段，還有許多問題需要解決。首先，最重要的是需要更好地定義正常干細(xì)胞以及各種腫瘤組織中CSCs的細(xì)胞生物學(xué)分子特征。由于CSCs中存在各種致癌突變的累積，CSCs的增殖和分化不僅依賴特定基因。顯然，靶向多種CSCs相關(guān)途徑的聯(lián)合療法及同時針對靜止期和增殖期CSCs的靶向藥物能更好地根除腫瘤細(xì)胞。例如，AML的復(fù)發(fā)與白血病干細(xì)胞和白血病前干細(xì)胞的存在密切相關(guān)［57］。這些細(xì)胞每年約以1%的頻率引起晚期復(fù)發(fā)。但相對于CSCs，這些惡變前細(xì)胞的分子和細(xì)胞生物學(xué)特征的復(fù)雜性較低，因此如果在癌癥出現(xiàn)之前能夠消除這些白血病前干細(xì)胞以及未來有可能成為CSCs的前體細(xì)胞，治療將更有效。利用單細(xì)胞基因表達(dá)檢測技術(shù)為腫瘤患者定制特異性靶向藥物，也有望清除所有腫瘤再生細(xì)胞，小分子抑制劑、生物制劑和針對CSCs的靶向免疫療法組合也有望進(jìn)入臨床并改善患者預(yù)后。