脊髓背角內(nèi)參與機(jī)械性痛覺(jué)超敏的神經(jīng)環(huán)路由損傷性質(zhì)決定

機(jī)械性痛覺(jué)超敏 (mechanical allodynia) 反應(yīng)是一種常見(jiàn)的慢性疼痛狀態(tài)，即非疼痛機(jī)械刺激在損傷后可引起疼痛反應(yīng)。研究顯示，脊髓背角是外周感覺(jué)信號(hào)整合的主要部位，也是導(dǎo)致機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)的神經(jīng)環(huán)路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵部位。脊髓背角中傳遞機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)的興奮性神經(jīng)元主要包括生長(zhǎng)抑素陽(yáng)性神經(jīng)元以及表達(dá)鈣結(jié)合蛋白 (CR)與蛋白激酶Cγ (PKCγ) 的神經(jīng)元。敲除上述興奮性神經(jīng)元可導(dǎo)致炎性損傷與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)形成缺陷。PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布于脊髓背角II/III層交界，少數(shù)分布于I層和III層，被認(rèn)為是損傷后允許低閾值機(jī)械感受信號(hào)傳入的“閘門”。最新研究顯示，分布于脊髓背角II-IV層的膽囊收縮素(CCK)陽(yáng)性神經(jīng)元也是低閾值機(jī)械感受器，與PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元高度重合，且在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，分布于脊髓背角II-IV層的瞬時(shí)囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(tVGLUT3) 陽(yáng)性神經(jīng)元以及分布于II層的CR陽(yáng)性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中同樣發(fā)揮重要的作用。本文作者通過(guò)藥理學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)方法研究了上述神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的作用，并探討上述神經(jīng)元的激活是否因損傷性質(zhì)而異。

首先，本文作者對(duì)分布于脊髓背角II層的CR陽(yáng)性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)合前期研究結(jié)果，CR陽(yáng)性神經(jīng)元能夠響應(yīng)角叉菜膠炎性痛模型中的低閾值機(jī)械刺激引起c-Fos（一個(gè)公認(rèn)的疼痛通路激活標(biāo)志物）顯著上調(diào)，而在坐骨神經(jīng)分支損傷 (SNI) 模型中響應(yīng)較少，作者提出假說(shuō)：CR陽(yáng)性神經(jīng)元主要傳遞炎性損傷而非神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)。為驗(yàn)證這一假說(shuō)，作者首先通過(guò)脊髓注射腺相關(guān)病毒8 (AAV8) 標(biāo)記CR陽(yáng)性神經(jīng)元以研究其特異性表征。結(jié)果顯示，脊髓背角II層的CR陽(yáng)性神經(jīng)元與速激肽1 (Tac1)、速激肽2 (Tac2)、胃泌素相關(guān)肽 (Grp) 陽(yáng)性神經(jīng)元的共表達(dá)比例分別為52%、21%、11%，而與PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)共表達(dá)。電生理實(shí)驗(yàn)表明，CR陽(yáng)性神經(jīng)元中，91%呈現(xiàn)延遲(Delayed)放電模式，9%呈現(xiàn)強(qiáng)直 (Tonic) 放電模式，且100%接收C纖維傳入信號(hào)，80%接收Aδ纖維傳入信號(hào)，但不接收Aβ纖維傳入信號(hào)。CR陽(yáng)性神經(jīng)元樹(shù)突形態(tài)豐富，包括放射狀、垂直狀以及未知類型，有趣的是，CR陽(yáng)性神經(jīng)元沿背腹方向明顯拉長(zhǎng)呈樹(shù)枝狀，提示其突觸連接可能延伸至脊髓背角II層以外。

隨后采用化學(xué)遺傳學(xué)方法，通過(guò)脊髓背角注射AAV8將抑制性受體PSAM-GlyR導(dǎo)入CRcre小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制CR神經(jīng)元的活性。為驗(yàn)證CR神經(jīng)元是否為炎性損傷或神經(jīng)損傷誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺(jué)超敏所必需，作者建立了多種炎性痛與神經(jīng)痛模型。在角叉菜膠炎性痛模型中，vonFrey縮爪閾值（靜態(tài)疼痛敏化）顯著降低，棉簽擦拭反應(yīng)性（ 動(dòng)態(tài)疼痛敏化）明顯增加，注射PSEM89S抑制CR神經(jīng)元活性后，vonFrey縮爪閾值顯著上調(diào)，而棉簽擦拭反應(yīng)性無(wú)改變。腳掌注射完全弗氏佐劑(CFA)炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)靜態(tài)與動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏狀態(tài)。而在SNI神經(jīng)損傷模型中，注射PSEM89S對(duì)靜態(tài)與動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏狀態(tài)均無(wú)影響。Brennan切口術(shù)后炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)靜態(tài)與動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏狀態(tài)。此外，本文作者還通過(guò)皮內(nèi)注射辣椒素（激活TRPV1）或芥子油（激活TRPA1）建立繼發(fā)性機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)模型。令人驚訝的是，注射PSEM89S能夠逆轉(zhuǎn)芥子油而非辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏，因?yàn)槔苯匪啬Ｐ捅徽J(rèn)為是一種神經(jīng)源性炎性痛模型。隨后研究發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射芥子油能夠誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)釋放，而與溶劑組相比，注射辣椒素對(duì)炎性介質(zhì)釋放無(wú)影響。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CR陽(yáng)性神經(jīng)元主要傳遞炎性損傷而非神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)，且辣椒素誘導(dǎo)的繼發(fā)性機(jī)械痛覺(jué)超敏屬于非CR神經(jīng)元依賴型。

接下來(lái)，對(duì)PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的作用進(jìn)行了探討。本文作者前期研究發(fā)現(xiàn)，PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元響應(yīng)SNI神經(jīng)損傷模型而非角叉菜膠炎性痛模型誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏，從而促進(jìn)c-Fos表達(dá)，提示PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元可能傳遞神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏。為了驗(yàn)證這一推論，首先通過(guò)在PKCγ起始密碼子插入膜結(jié)合GFP (mGFP) 標(biāo)記PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元以研究其特異性表征。結(jié)果顯示，PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元放電模式較CR神經(jīng)元更豐富，包括強(qiáng)直型 (Tonic,35.7%)，相位型 (Phasic, 28.6%)，延遲型 (Delayed,28.6%)和間歇型 (Gap, 7.1%)。此外，PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元能夠接收Aδ、Aβ與C纖維傳入信號(hào)，其中絕大多數(shù)傳入信號(hào)來(lái)自于Aδ纖維。PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)主要呈中央和放射狀，少數(shù)呈現(xiàn)垂直狀。

本文作者采用PKCγ KO小鼠或鞘內(nèi)注射PKCγ選擇性抑制劑tat-gV5-3抑制PKCγ的活性，研究了PKCγ在炎性損傷或神經(jīng)損傷誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺(jué)超敏中的作用。結(jié)果顯示，PKCγ KO或鞘內(nèi)注射tat-gV5-3對(duì)角叉菜膠、CFA炎性痛模型，Brennan切口術(shù)后炎性痛模型，芥子油繼發(fā)性痛覺(jué)超敏模型誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)均無(wú)影響。然而，PKCγ KO或鞘內(nèi)注射tat-gV5-3均能緩解SNI模型誘導(dǎo)的疼痛超敏反應(yīng)。此外，鞘內(nèi)注射tat-gV5-3還能緩解辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)。提示PKCγ本身是神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)機(jī)械性疼痛異常信號(hào)傳遞所必需。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PKCγ神經(jīng)元的作用，本文作者通過(guò)脊髓背角注射PSAM-GlyR導(dǎo)入PKCγcreERT2小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制PKCγ神經(jīng)元的活性。結(jié)果顯示，CFA炎性痛模型中，注射PSEM89S對(duì)vonFrey縮爪閾值及棉簽擦拭反應(yīng)性均無(wú)影響。SNI神經(jīng)損傷模型中，注射PSEM89S后vonFrey縮爪閾值顯著增加，棉簽擦拭反應(yīng)性明顯降低。此外，注射PSEM89S還能部分緩解辣椒素誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)。上述結(jié)果首次證明除了PKCγ本身，PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)傳遞神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)同樣具有重要的作用。

接著，研究了脊髓背角深層神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的作用。CCK神經(jīng)元遍布整個(gè)脊髓背角，主要集中在II-IV層。通過(guò)脊髓注射AAV8標(biāo)記CCK陽(yáng)性神經(jīng)元以研究其特異性表征，結(jié)果顯示，標(biāo)記神經(jīng)元主要分布于脊髓背角深層(III-IV層)，且與CR或PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元均無(wú)共表達(dá)，其放電模式包括相位型 (Phasic, 67%) 與強(qiáng)直型 (Tonic,33%)，神經(jīng)元軸突主要向背腹方向延伸。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK神經(jīng)元的作用，作者通過(guò)脊髓背角注射PSAM-GlyR導(dǎo)入CCKcre小鼠。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，注射PSEM89S能夠顯著緩解炎性痛模型（角叉菜膠與CFA模型）與神經(jīng)病理性疼痛模型（SNI模型）誘導(dǎo)的靜態(tài)及動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)，且可緩解角叉菜膠模型引起的熱痛超敏反應(yīng)，提示位于脊髓背角III-IV層的PKCγ-CCK神經(jīng)元能夠傳遞炎性損傷以及神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)。

最后，研究了tVGLUT3神經(jīng)元在機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的作用及其與CCK神經(jīng)元之間的關(guān)系。前期研究結(jié)果提示，tVGLUT3神經(jīng)元分布于脊髓背角II-IV層，敲除tVGLUT3神經(jīng)元后能夠顯著抑制動(dòng)態(tài)而非靜態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)。通過(guò)脊髓注射AAV8標(biāo)記tVGLUT3陽(yáng)性神經(jīng)元，結(jié)果顯示標(biāo)記神經(jīng)元分布于III-IV層，且與CR或PKCγ陽(yáng)性神經(jīng)元均無(wú)共表達(dá)。作者通過(guò)脊髓注射PSAM-GlyR導(dǎo)入tVGLUT3cre小鼠，注射PSEM89S能夠完全逆轉(zhuǎn)角叉菜膠及SNI模型誘導(dǎo)的機(jī)械性動(dòng)態(tài)疼痛超敏反應(yīng)。為了進(jìn)一步研究tVGLUT3神經(jīng)元與CCK神經(jīng)元之間的關(guān)系，作者通過(guò)脊髓注射AAV8將EGFP導(dǎo)入tVGLUT3cre小鼠進(jìn)行標(biāo)記，10～14天后與探針標(biāo)記CCK及Maf, Cpne4, Trh（CCK神經(jīng)元根據(jù)基因表達(dá)可分為三類：Maf+, Cpne4+, Trh+神經(jīng)元）的小鼠進(jìn)行原位雜交，結(jié)果顯示大部分EGFP標(biāo)記的III-IV層tVGLUT3神經(jīng)元與CCK神經(jīng)元共表達(dá)(81%)，且共表達(dá)的CCK神經(jīng)元主要為Maf陽(yáng)性CCK神經(jīng)元 (81%)，少數(shù)為Cpne4陽(yáng)性CCK神經(jīng)元，但無(wú)Trh陽(yáng)性CCK神經(jīng)元，提示傳遞神經(jīng)損傷與炎性損傷誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)的CCK神經(jīng)元主要由tVGLUT3神經(jīng)元組成。

綜上所述，雖然炎性損傷與神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)相似，但脊髓背角神經(jīng)環(huán)路的激活卻因損傷性質(zhì)而異。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角興奮性神經(jīng)元對(duì)機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)的傳遞至關(guān)重要，其中脊髓背角II層的CR神經(jīng)元主要傳遞由具有顯著炎癥指標(biāo)的炎性損傷引起的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)，PKCγ神經(jīng)元傳遞由神經(jīng)損傷而非炎性損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)，且PKCγ激酶本身也參與該信號(hào)的傳遞，脊髓背角深層的CCK神經(jīng)元在傳遞炎性損傷及神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)中發(fā)揮重要作用。研究還證明，位于III-IV層的Maf 陽(yáng)性CCK神經(jīng)元由tVGLUT3神經(jīng)元組成，主要傳遞動(dòng)態(tài)機(jī)械性痛覺(jué)超敏信號(hào)。

本研究證實(shí)了PKCγ神經(jīng)元在神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)超敏反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，該類神經(jīng)元的突起向脊髓背角腹側(cè)方向延伸，提示來(lái)自抑制性IIi層神經(jīng)元的感受信號(hào)能夠在脊髓背角深層神經(jīng)元整合以傳遞痛覺(jué)超敏信號(hào)。這一門控機(jī)制是否存在于炎性損傷誘導(dǎo)的痛覺(jué)超敏反應(yīng)中還需進(jìn)一步研究。本研究數(shù)據(jù)表明，脊髓背角深層神經(jīng)元對(duì)炎性損傷痛覺(jué)超敏神經(jīng)環(huán)路至關(guān)重要，這可能并不依賴于垂直細(xì)胞，因?yàn)镃R神經(jīng)元軸突同樣與I層的外周神經(jīng)元連接。根據(jù)損傷性質(zhì)研究機(jī)械性痛覺(jué)超敏神經(jīng)環(huán)路是未來(lái)的主要研究方向，對(duì)理解機(jī)械性痛覺(jué)超敏的形成機(jī)制以及尋找有效的治療方法具有重要的意義。