復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病的免疫機制及免疫治療

許瑩瑩 劉萍 馮勤梅

75%的婦女一生中至少感染一次外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)，有10%左右的女性會因為某些原因在一年內(nèi)感染4次或以上而發(fā)展成為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)[1]。盡管使用抗真菌藥物能減少感染，但是復(fù)發(fā)率很高，很難治愈。因此探究RVVC病因以及尋找更為精準(zhǔn)的治療方法具有重要的臨床意義。RVVC反復(fù)發(fā)作的機制尚不完全明確，常見的誘因有糖耐量異常、雌激素水平波動、長期應(yīng)用免疫抑制劑及廣譜抗生素等[2]。90%的RVVC患者的發(fā)病是由白假絲酵母菌病原體引起，但絕大多數(shù)患者的發(fā)病并沒有明確的誘因，因而考慮個體異質(zhì)性及遺傳易感性因素可能是影響RVVC易感性的主要因素。本文對近年RVVC發(fā)病的相關(guān)免疫機制及免疫治療研究進行總結(jié)。

一、RVVC發(fā)病的固有免疫機制

1.多形核中性粒細(xì)胞缺陷：機體通過固有免疫細(xì)胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)與假絲酵母菌表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)結(jié)合，產(chǎn)生釋放防御素、細(xì)胞因子等殺滅病原菌。此過程中多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear，PMN)大量聚集，引起陰道上皮細(xì)胞損傷，造成RVVC的癥狀性感染。然而大量PMNs的聚集并沒有清除假絲酵母菌，而是導(dǎo)致陰道粘膜處于慢性炎癥狀態(tài)[3]。因此推測PMN反應(yīng)以及趨化因子缺陷是造成宿主易感性的一個重要原因。陰道分泌物中的硫酸乙酰肝素會作為假定的競爭性Mac-1配體干擾PMN與假絲酵母菌的相互作用，造成PMN功能障礙，導(dǎo)致RVVC[4]。PMN功能障礙相關(guān)機制的探索對于RVVC免疫靶向性治療有很大的價值。

2.MBL 基因多態(tài)性：甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)是天然免疫系統(tǒng)的一部分，可以結(jié)合在念珠菌細(xì)胞壁表面，啟動補體激活系統(tǒng)，減少感染。研究表明，MBL2基因的多態(tài)性，特別是在codon 54(變異等位基因 B；野生型等位基因A)，攜帶MBL2等位基因B的女性發(fā)生RVVC的風(fēng)險增加了3倍[5]。有研究認(rèn)為MBL2 Y/X多態(tài)性與RVVC的易感性有關(guān)，攜帶等位基因X的婦女患VVC的風(fēng)險比攜帶Y的婦女高1.52倍[6]。Babula等[7]研究表明，與對照組相比，白細(xì)胞介素-4(interleukin，IL)T/T基因型RVVC患者陰道灌洗液中IL-4濃度增加2倍，MBL濃度降低2倍，考慮免疫因子水平的降低可能增加RVVC的易感性，表明IL-4中-589T/C 與RVVC易感性有關(guān)。鑒于血清及陰道分泌物中MBL水平會受到基因多態(tài)性及其他細(xì)胞因子的影響，因此MBL基因型的分析可作為MBL血清水平的替代物來識別缺乏MBL的女性，從而能夠給予相應(yīng)治療，例如尚待證明有效性的MBL蛋白。

3.Toll樣受體及Dectin-1基因多態(tài)性：Toll樣受體(Toll-like Receptors,TLRs)是發(fā)現(xiàn)最早的一種模式識別受體，TLR2與樹突狀細(xì)胞C型植物血凝素1(Dectin-1)協(xié)同誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，Dectin-1也可以通過脾酪氨酸激酶/胱天蛋白募集域蛋白9(spleen tyrosine kinase/cysteone recruitment domain protein 9，Syk/CARD9)依賴通路誘導(dǎo)IL-17、IL-6和IL-10的產(chǎn)生。TLR2Pro631His多態(tài)性通過降低γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-17水平使得RVVC的易感性增高3倍[8]。此外，Dectin-1(Y238X)中的早期終止密碼子突變導(dǎo)致β-葡聚糖識別和輔助性T細(xì)胞-17(helperT-17，Th17)應(yīng)答的缺陷。但是有研究[9]表明，RVVC易感性與伊朗人群Dectin-1Y238X多態(tài)性之間沒有顯著相關(guān)性，這些差異可以歸結(jié)為不同種族之間的遺傳異質(zhì)性，表明有必要對不同人群中的基因多態(tài)性進行研究來更精準(zhǔn)地指導(dǎo)治療。

4.NLRP3基因多態(tài)性：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide binding oligomeric domain like receptor family pyrin domain protein 3，NLRP3)是炎性小體的重要組成部分。炎性小體是一類由PRRs參與組裝的多蛋白復(fù)合體，能夠識別PAMPs或者宿主來源的危險信號分子。NLRP3通過胱冬肽酶-1(caspase-1)激活I(lǐng)L-1β和IL-18。研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因的等位基因7與RVVC發(fā)病的頻率增加有關(guān)[7]。Jaeger[10]等人分析發(fā)現(xiàn)RVVC患者及對照之間12/9基因型差異比較明顯(P=0.02)，進一步研究表明攜帶12/9基因型的RVVC患者陰道表面IL- 1β的產(chǎn)生高于對照組，IL- 1Ra水平下降，IL-18水平保持不變。這些結(jié)果表明，NLRP3/IL-1β通路在RVVC的發(fā)病機制中起著重要作用，因此可作為RVVC潛在的治療靶點。

5. IL-22基因突變：細(xì)胞因子IL-22的突變也會增加RVVC易感性[11]。產(chǎn)生IL-22的細(xì)胞很多，新近發(fā)現(xiàn)的固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells，ILCs)存在于粘膜屏障表面，乳酸桿菌可以通過產(chǎn)生芳香烴受體配體，通過ILC3促進IL-22的產(chǎn)生，IL-22可以通過控制假絲酵母菌的生長形態(tài)來增加抗菌肽的產(chǎn)生，也可以通過磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activators，STAT3)來保持上皮細(xì)胞的完整性。IL22基因rs2227485位點的TT基因型與RVVC發(fā)病風(fēng)險降低具有顯著的相關(guān)性(OR=0.48，P=0.01)。

二、RVVC發(fā)病的適應(yīng)性免疫機制

適應(yīng)性免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫，其中又以Th及其相關(guān)免疫因子為代表的細(xì)胞免疫作為陰道局部抵抗假絲酵母菌的主要適應(yīng)性免疫防御機制。Th主要包括Th1、Th2及Th17 、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)。

1. Th1/Th2平衡破壞：Th1表達IL-2、IL-8、IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子提高免疫活性來抵抗假絲酵母菌的侵襲。Th2表達的IL-4、IL-6、IL-10 與感染的持續(xù)和慢性化相關(guān)，對Th1應(yīng)答有抑制作用進而使機體對真菌易感。Th1與Th2平衡破壞會使Th1介導(dǎo)的正常預(yù)防性反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h2反應(yīng)，使宿主出現(xiàn)一種遲發(fā)型過敏反應(yīng)。Neves[12]研究表明單用氟康唑治療無效的RVVC患者聯(lián)合口服抗組胺藥西替利嗪治療可緩解癥狀。White[13]應(yīng)用抗過敏藥扎魯斯特治療20例 RVVC 患者也取得了一定的效果，提示過敏反應(yīng)可能參與RVVC的感染。

2. Th17/Treg平衡破壞：Th17分泌IL-17激活其他促炎因子、粒細(xì)胞趨化因子、抗菌肽及基質(zhì)金屬蛋白酶防御假絲酵母菌。吲哚胺2，3-雙加氧酶/芳香化烴受體(indoleamine dioxygenase/Aromatic hydrocarbon receptors，IDO-AHR)軸控制著Th17/Treg的免疫平衡[14]。IDO1基因rs3808606的TT基因型也與RVVC的易感性相關(guān)(OR=0.51，P=0.02)[11]。此外，梁軼珩等[15]通過測定不同時期 Th17 相關(guān)細(xì)胞因子變化，表明緩解期 IL-17A 的正常表達對預(yù)防RVVC有重要作用。因此維持細(xì)胞免疫的平衡對于預(yù)防RVVC的復(fù)發(fā)有著重要意義。

三、RVVC治療中微生態(tài)制劑的應(yīng)用

隨著陰道微生態(tài)概念的提出，乳酸桿菌也逐漸被證明是陰道微環(huán)境中的有益菌，它可以通過競爭排除致病菌，競爭營養(yǎng)素，生成抗菌物質(zhì)，激活免疫系統(tǒng)來維持健康的陰道菌群[16]。乳酸桿菌可以通過增加活性氧、IL-8、IL-6、IL-12等的產(chǎn)生，上調(diào)NF-κB及TLR-2信號通路，增加巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌活性[17]。實驗觀察到陰道中乳酸桿菌和假絲酵母菌共同存在可以減少真菌的粘附，且卷曲螺桿菌可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生人防御素2(human beta-defensin 2，HBD-2)[18]。表明乳酸桿菌通過激活免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)，刺激免疫細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)機體的免疫狀態(tài)來恢復(fù)陰道菌群。李軍英[19]研究表明抗真菌藥物聯(lián)合微生態(tài)制劑治療RVVC的總有效率高達92.5%，復(fù)發(fā)率為2.5%，顯著優(yōu)于僅使用抗真菌藥物治療患者的62.5%和32.5%(P<0.05)。一項前瞻性研究[20]表明應(yīng)用11001 l型乳酸桿菌片協(xié)同單劑氯丙唑500 mg治療可使VVC的復(fù)發(fā)風(fēng)險降低3倍。因此可以考慮將乳酸桿菌轉(zhuǎn)化為克隆載體，利用其自身的作用或者攜帶假絲酵母菌抗原來達到治療RVVC的作用。

四、RVVC疫苗

疫苗的作用是促進抗原特異性免疫反應(yīng)，并引發(fā)針對特定致病菌株的保護性免疫記憶。白假絲酵母菌是一種多態(tài)真菌，菌絲態(tài)毒力更強。酵母菌細(xì)胞壁是PRRs-PAMPs相互作用的中樞，決定下游的免疫反應(yīng)。當(dāng)假絲酵母菌侵襲人體時，菌絲表面黏附素和侵襲素會與宿主上皮細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合促進黏附；同時菌絲尖端分泌水解酶和溶解素，侵襲和破壞細(xì)胞膜的完整性，減弱宿主細(xì)胞的防御能力[21]。因此可以根據(jù)假絲酵母菌的抗原性來制備疫苗，相關(guān)疫苗可以分為三種：活減毒株，糖偶聯(lián)物和重組蛋白。

1.減毒活株疫苗：由于白假絲酵母菌的菌絲態(tài)毒力更強，制備減毒活株疫苗普遍采用去除菌絲結(jié)構(gòu)的方式達到減毒作用。小鼠實驗已經(jīng)證明了幾種無毒或低毒力的假絲酵母菌突變體的保護作用，但是由于現(xiàn)有實驗減毒活株疫苗缺少穩(wěn)定性，考慮到其應(yīng)用的安全性，并未進入臨床試驗[22]。

2.糖偶聯(lián)物疫苗：糖偶聯(lián)物疫苗由聚糖制備，該種聚糖在真菌細(xì)胞壁中常見，在宿主細(xì)胞中不存在。其中β-葡聚糖是假絲酵母菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵成分，可能與宿主細(xì)胞粘附有關(guān)。體外和體內(nèi)研究顯示來自海帶屬及其衍生物的海藻的β-葡聚糖可誘導(dǎo)最初的細(xì)胞因子的活化，引發(fā)依賴Dectin -1的固有免疫反應(yīng)，進而增加吞噬細(xì)胞殺傷微生物的潛力。具有佐劑的β-葡聚糖綴合物可能有助于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗β-葡聚糖抗體的疫苗，其能夠抵抗多種真菌的侵襲作用[23]。

3.重組蛋白疫苗：重組蛋白疫苗主要由與真菌毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，不含病原體，因此對人體更安全。目前的研究表明，最強的適應(yīng)性免疫記憶反應(yīng)是針對與菌絲相關(guān)的蛋白質(zhì)。凝集素樣序列基因(agglutinin-Like Sequence，Als)表達于酵母菌菌絲，有助于酵母菌粘附和侵入人體內(nèi)皮。NDV-3是一種含有Als3抗原的疫苗，研究表明應(yīng)用NDV-3A制備的疫苗在RVVC患者體內(nèi)誘導(dǎo)了強烈的抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，在12個月的研究期間，有RVVC病史的小于40歲的患者復(fù)發(fā)的時間間隔延長(接種疫苗患者210天，安慰劑患者105天)[24]。該疫苗的作用效果可以通過測定血清中IgG2的抗體滴度來評價[25]。

分泌型天冬氨酰蛋白酶(secretory aspartic acid protease，Sap)是白假絲酵母菌分泌的一種胞外蛋白酶，將Sap2與病毒顆粒重組得到疫苗PEV7，大鼠體內(nèi)注射PEV7后可以在陰道分泌物中檢測到IgG和IgA的產(chǎn)生。在Ⅰ期臨床試驗中，無論肌肉注射還是陰道給藥，在受試者血清、陰道樣本中均觀察到快速特異的B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[26]。菌絲調(diào)節(jié)蛋白1(yeast-hyphal regulational gene，Hyr1)是一種糖基磷脂酰肌醇——錨定型甘露聚糖蛋白，在菌絲形成過程中表達，可以抑制先天免疫系統(tǒng)殺滅假絲酵母菌的能力。研究表明使用大腸桿菌重組制備Hyr1可以使小鼠免受假絲酵母菌的侵襲[22]。

綜上所述，RVVC的高發(fā)生率和常規(guī)抗真菌療法的不足構(gòu)成了對開發(fā)免治療的強烈的醫(yī)學(xué)需求?？紤]到機體的局部免疫在其中起著重要作用，外源性細(xì)胞因子，抗體和免疫調(diào)節(jié)劑的使用是潛在的研究方向，聯(lián)合疫苗也因為其可能更有效地防止不同位點和組織特異性的假絲酵母菌感染，將會是未來的研究熱點。當(dāng)然這些方案仍需在臨床上進行更大樣本量的研究來證實。繼續(xù)探討發(fā)病的相關(guān)免疫機制，進一步的實驗驗證免疫制劑有效性和安全性，可能對推動RVVC臨床治療方式的進展起到非常重要的作用。