磷酸鎂骨水泥緩凝改性及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)展

龔長天，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨外科，武漢430060)

創(chuàng)傷、腫瘤等因素導(dǎo)致的大塊骨缺損是困擾骨科醫(yī)師的臨床難題，其定義為超過長骨直徑1.5倍的骨缺損［1］。骨移植被認(rèn)為是大塊骨缺損治療的金標(biāo)準(zhǔn)，然而自體骨移植供區(qū)骨量有限，異體骨移植有潛在疾病傳播、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重等問題［2］。近年來人工合成材料常被用于大塊骨缺損的治療。聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥因具有較高機(jī)械強(qiáng)度、術(shù)中易于成型等優(yōu)點(diǎn)常用于椎體成形術(shù)中，但聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥自固化過程放出的高熱會(huì)引起缺損處二次損傷，而且單體具有細(xì)胞毒性、植入部位易形成界面松動(dòng)，以上缺點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用［3］。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate bone cement，CPC)的主要成分與天然骨無機(jī)相類似，兼具良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性，但CPC機(jī)械強(qiáng)度較低，同時(shí)不具備骨誘導(dǎo)功能，難以形成缺損處新骨爬行替代［4］。為解決CPC體系中現(xiàn)存的問題，研究者開發(fā)了衍生的磷酸鎂骨水泥(magnesium phosphate bone cement，MPC)。MPC在水化反應(yīng)早期具備高抗壓強(qiáng)度，術(shù)中可快速凝固，其主要產(chǎn)物磷酸鎂鹽具有良好的生物相容性，可于內(nèi)環(huán)境中生物降解，另外添加改性物質(zhì)后的復(fù)合MPC能夠滿足多樣化的臨床需求［5］?，F(xiàn)就MPC體系改性策略及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 MPC體系簡介

MPC由固相和液相構(gòu)成，固相以高溫煅燒氧化鎂、磷酸鹽粉末為主體，液相以純水等固化液為主體，固液兩相在室溫條件下以一定比例均勻混合后可制備MPC，MPC各組分間的性質(zhì)與配比共同決定了MPC的理化性質(zhì)及生物學(xué)性能［6］。MPC的固化反應(yīng)是一種快速水化離子反應(yīng)，為MPC早期提供了早期高抗壓強(qiáng)度，但在反應(yīng)的同時(shí)會(huì)釋放大量的熱，不利于MPC的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，因此MPC體系中需要緩凝劑降低峰值溫度、延長放熱時(shí)間，為臨床操作提供合適的時(shí)間窗［7］。

2 改性緩凝劑種類及其添加策略

2.1 常見改性緩凝劑種類

2.1.1 生物活性物質(zhì) 生物活性物質(zhì)是指具備功能性基團(tuán)的有機(jī)物，能在MPC體系中發(fā)揮緩凝作用的同時(shí)提高生物相容性［8］。生物活性物質(zhì)常選擇在骨水泥液相中具有一定溶解度的物質(zhì)，能在水化反應(yīng)中與氧化鎂發(fā)生競爭性溶解，減緩鎂離子(Mg2+)及氫氧根的釋放速率，從而發(fā)揮緩凝作用。殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，其分子鏈上的氨基及羧基使其具備促成骨細(xì)胞分化、增殖的能力。Liao等［9］將一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)殼聚糖加入MPC體系中制備了殼聚糖MPC，結(jié)果顯示0.2%～2%添加含量的殼聚糖MPC抗壓強(qiáng)度為45～170 Mpa，凝結(jié)時(shí)間為12～20 min，抗?jié)⑸⑿暂^MPC大大提高。其原因可能是主要水化產(chǎn)物磷酸鎂銨晶體包裹在氨基與Mg2+之間形成的橋式聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，形成致密結(jié)構(gòu)，最終提高抗壓強(qiáng)度及抗?jié)⑸⑿裕撗芯课瓷钊胗懻摎ぞ厶荕PC的生物學(xué)表現(xiàn)。Kim等［10］使用茚二酮(indene，KR34893)與3D打印技術(shù)聯(lián)合制備了KR－MPC，重點(diǎn)關(guān)注了KR－MPC的生物學(xué)性能，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、Western blot等結(jié)果顯示人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠成骨細(xì)胞(MC3T3－E1)中礦物質(zhì)沉積和成骨細(xì)胞標(biāo)記基因(Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2、堿性磷酸酶、人Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白)的體外表達(dá)顯著升高。SD大鼠顱骨缺損結(jié)果表明，與對(duì)照組MPC相比，KR－MPC能更好地促進(jìn)骨再生。

細(xì)胞因子類物質(zhì)是由細(xì)胞分泌的具有特殊生物學(xué)功能的小分子蛋白質(zhì)，近年來也被用于MPC的改性［11］。細(xì)胞因子類物質(zhì)的生物學(xué)功能與構(gòu)象相對(duì)應(yīng)，MPC水化反應(yīng)產(chǎn)生的高熱對(duì)其構(gòu)象有潛在損傷，因此目前研究常使用細(xì)胞因子類物質(zhì)對(duì)預(yù)成型后的MPC進(jìn)行修飾，以獲得具備最佳生物學(xué)表現(xiàn)的復(fù)合MPC。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是存在于多種細(xì)胞生理行為中的功能再生因子，尤其在骨缺損修復(fù)中起重要作用［12］。Ding等［13］使用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2(recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP－2)對(duì)固化后MPC樣品進(jìn)行了修飾，與CPC/rhBMP－2相比，MPC/rhBMP－2復(fù)合支架的體外成骨分化和磷酸化顯著增強(qiáng)，其生物活性增強(qiáng)的潛在機(jī)制是Mg2+通過Smad信號(hào)通路促進(jìn)rhBMP－2的表達(dá)水平升高，繼而增強(qiáng)MPC體外成骨誘導(dǎo)分化能力;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也印證了以上結(jié)論，植入8周后的微型CT結(jié)果證實(shí)CPC/rhBMP－2和MCPC/rhBMP－2均被新生骨組織包裹，且后者周圍形成了更多的新生骨組織。

2.1.2 無機(jī)非金屬物質(zhì) MPC在研究早期常被用作提高CPC體系機(jī)械強(qiáng)度的添加物，近年來才作為骨水泥主體進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)研究，所以MPC體系常選用CPC進(jìn)行體系合并，本質(zhì)上是調(diào)整了兩者之間的比例［14］。大多數(shù)CPC的凝結(jié)時(shí)間遠(yuǎn)長于MPC，體系合并后的復(fù)合MPC峰值溫度下降、放熱反應(yīng)時(shí)間延長，拓展了其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用范圍;另外由于兩者的反應(yīng)機(jī)制相近，復(fù)合MPC的機(jī)械性能獲得較大提升。Yu等［15］向MPC中加入了一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%～65%)的磷酸二氫鈣制備了磷酸鈣鎂骨水泥(calciummagnesium phosphate bone cement，CMPC)，結(jié)果表明CMPC凝固時(shí)間延長(0%～65%，6～18 min)，抗壓強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，40%含量組最高可達(dá)31.2 Mpa;此外復(fù)合CMPC可于三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中體外降解。CMPC浸提液的細(xì)胞毒性測(cè)試也證明CMPC具有良好的生物相容性。Liu等［16］使用生物活性α－磷酸三鈣(α－tricalcium phosphate，α－TCP)對(duì)MPC進(jìn)行改性，結(jié)果表明α－TCP的引入使MPC的早期強(qiáng)度略有降低，7 d后MPC抗壓強(qiáng)度增加;當(dāng)α－TCP添加含量為8%時(shí)，抗壓強(qiáng)度可達(dá)68 MPa。體外于純水和模擬體液中浸泡56 d后α－TCP－MPC組的剩余抗壓強(qiáng)度及質(zhì)量顯著高于MPC組。同時(shí)新西蘭白兔股骨髁植入實(shí)驗(yàn)表明α－TCP－MPC組植入部位周圍組織未見炎癥細(xì)胞聚集及病理改變，12周后材料組織交界區(qū)域有明顯膠原沉積，α－TCP－MPC組周圍部分新生骨已改建為成熟骨組織且新生骨量高于MPC組?？梢?，α－TCP－MPC不僅可在體內(nèi)生物降解，還具備良好的骨誘導(dǎo)能力，誘導(dǎo)缺損處新生骨的自身替代。

2.2 改性策略 改性策略的選擇要點(diǎn)主要集中于添加方式與添加含量［17］。MPC體系由固液兩相構(gòu)成，同種物質(zhì)可分別由固相液相添加，另外添加含量也影響MPC的整體表現(xiàn)。Yu等［18］和Wang等［19］將磷酸二氫鈣與檸檬酸加入MPC中進(jìn)行改性，其中檸檬酸從固液兩相分別添加，結(jié)果顯示在主要產(chǎn)物相成分未改變的前提下，固相添加使MPC的凝結(jié)時(shí)間更長、早期抗壓強(qiáng)度更強(qiáng)、孔隙率更高。其原因可能是固相添加時(shí)檸檬酸在水化反應(yīng)過程中存在溶解過程，延后了作用時(shí)間，使水化反應(yīng)更加徹底，主要產(chǎn)物的磷酸鎂鹽含量增加。但兩種添加方式細(xì)胞水平生物表現(xiàn)無明顯差異，檸檬酸中包含的功能性基團(tuán)均使MPC生物相容性提高，說明添加方式主要影響MPC基礎(chǔ)物化性質(zhì)，尤其是對(duì)于生物相容性的影響相對(duì)較小，生物相容性的變化主要與物質(zhì)種類相關(guān)。MPC體系的最大改性物質(zhì)容納量為10%左右，最佳添加含量為5%左右，這為MPC體系中新改性物質(zhì)初始添加含量的選擇提供了理論依據(jù)。Yu等［20］將不同比例的羧甲基殼聚糖(0%～10%)加入MPC中制備了新型可注射復(fù)合羧甲基殼聚糖/CMPC，分別對(duì)CMPC的物化性質(zhì)、顯微結(jié)構(gòu)及其表面成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化情況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與MPC相比，CMPC凝固時(shí)間較長，凝固溫度較低;含5%羧甲基殼聚糖的CMPC抗壓強(qiáng)度和抗沖蝕性能最高;成骨細(xì)胞在CMPC標(biāo)本上的黏附、增殖和分化程度均優(yōu)于MPC，且5%添加含量組綜合性能最佳。曹霄峰等［21］分別使用2%、6%、10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膠原肽對(duì)MPC進(jìn)行改性，結(jié)果表明MPC水化反應(yīng)峰值溫度由63℃下降到50℃(10%)，同時(shí)放熱峰出現(xiàn)時(shí)間延后200 s;適量的膠原肽在不改變MPC體系主要產(chǎn)物物相的前提下，對(duì)復(fù)合骨水泥具有良好的緩凝作用(8 min)，同時(shí)能夠提高復(fù)合骨水泥的抗壓強(qiáng)度(6%，39.5 Mpa)，但進(jìn)一步提高膠原肽的含量會(huì)降低復(fù)合骨水泥的抗壓強(qiáng)度(10%，28 Mpa)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠原肽的加入可促進(jìn)MC3T3－E1細(xì)胞和L929細(xì)胞的增殖，且無明顯細(xì)胞毒性。

3 MPC的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 炎癥治療 骨髓炎是青少年骨科常見疾病，也是導(dǎo)致青少年骨缺損的主要原因之一［22］。由于MPC同時(shí)具備載抗生素及生物降解能力，能為感染區(qū)域局部遞送抗生素的同時(shí)減少全身耐藥事件的發(fā)生，近年來得到廣泛關(guān)注［23］。金黃色葡萄球菌是常見骨髓炎致病菌，特異性針對(duì)金黃色葡萄球菌的抗生素骨水泥目前尚不多見［24］。Mestres等［25］通過新西蘭白兔股骨骨髓炎模型系統(tǒng)評(píng)價(jià)了不同配方抗菌骨水泥治療骨髓炎的效能，共選取了5種骨水泥進(jìn)行評(píng)估:無孔及大孔載多西環(huán)素的CPC、以上兩者的非載藥空白對(duì)照以及無孔不含多西環(huán)素的MPC。金黃色葡萄球菌體外生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大孔載藥CPC組抗菌效果最佳，其原因是大孔隙結(jié)構(gòu)相對(duì)表面積最大，利于液體交換及成骨細(xì)胞的增殖、血管化，增加了多西環(huán)素的局部釋放速率，提高了多西環(huán)素的局部濃度。MPC組顯示出了僅次于大孔載藥CPC組的抗菌效果，說明MPC在無孔且不負(fù)載多西環(huán)素的情況下即可發(fā)揮抗菌作用，這可能與MPC主要降解產(chǎn)物呈堿性相關(guān)。Cabrejos－Azama等［26］將Mg2+摻雜入鈣磷石中制備復(fù)合TCP－MPC，體外探究其對(duì)金黃色葡萄球菌感染的治療效果，結(jié)果顯示萬古霉素的持續(xù)釋放依賴于水泥基質(zhì)中Mg2+濃度，且26%Mg2+負(fù)載TCP－MPC抗菌性能最佳，有助于預(yù)防骨再生過程中的感染。

3.2 3D打印 3D打印技術(shù)是一項(xiàng)新興的數(shù)字化快速成型技術(shù)，在計(jì)算機(jī)輔助下，以物體的幾何參數(shù)為基礎(chǔ)，利用相關(guān)打印材料，能夠高精度構(gòu)造復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物理模型［27］。3D打印技術(shù)在個(gè)性化治療骨缺損中價(jià)值巨大，尤其是不規(guī)則骨缺損的重建，近年來受到廣泛關(guān)注［28］。具有良好可塑性的生物陶瓷材料是常用的3D打印材料，其主要優(yōu)點(diǎn)在于成分類似于天然骨無機(jī)成分，具有優(yōu)良的抗壓強(qiáng)度、骨傳導(dǎo)等性能，同時(shí)還有良好的生物降解及較強(qiáng)的生物相容性，MPC是其中常見的打印材料之一［29］。Klammert等［30］采用新型兩步法室溫3D打印制備了三維多孔MPC支架，該方法可在制備三維支架的同時(shí)負(fù)載生物活性物質(zhì)。與傳統(tǒng)先燒結(jié)后修飾工藝相比，該工藝大大提高了緩釋載藥效率及性能。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPC支架材料不僅具有良好的三維互聯(lián)孔結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、可降解性，還具有良好的細(xì)胞黏附性能和體外生物相容性，滿足了理想的支架材料用于硬組織再生的條件。鍶離子(Sr2+)可以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥并促進(jìn)骨形成，在骨生物材料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［31］。Meininger等［32］利用3D打印粉末、高溫?zé)Y(jié)和(或)化學(xué)轉(zhuǎn)化等3D打印技術(shù)制備了Sr2+取代Mg3(PO4)2的型生物降解MPC。結(jié)果表明，新型MPC的平均抗壓強(qiáng)度為36.7 MPa、抗彎強(qiáng)度為24.2 MPa、拉伸強(qiáng)度為10.7 MPa，能夠滿足骨缺損修復(fù)材料的基礎(chǔ)參數(shù)需求。CT則揭示了復(fù)合支架具有高度互聯(lián)的多孔結(jié)構(gòu)與正態(tài)分布的三維孔隙，其孔隙大小為17.74～26.29μm。此外，體外離子釋放研究結(jié)果顯示Mg2+釋放減少，而Sr2+可以緩慢而穩(wěn)定地從復(fù)合支架中連續(xù)釋放。Golafshan等［33］則利用Sr2+、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)和磷酸鎂陶瓷(magnesium phosphate ceramics，MgP)通過擠壓輔助3D打印法制備了摻鍶復(fù)合PCL－MgPSr支架，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含有30%質(zhì)量分?jǐn)?shù)PCL的MgPSr支架大孔隙率約40%，抗壓強(qiáng)度為4.3 MPa，同時(shí)MgPSr－PCL30支架無需補(bǔ)充骨誘導(dǎo)成分即可在體外誘導(dǎo)新骨生成。此外，馬髖臼大塊骨缺損模型的微型CT及組織學(xué)分析結(jié)果表明MgPSr－PCL30支架可在體內(nèi)穩(wěn)定降解6個(gè)月，同時(shí)可誘導(dǎo)骨再生填補(bǔ)缺損處。

3.3 仿生成孔 天然骨組織具備3D多孔結(jié)構(gòu)，利于局部物質(zhì)交換及新陳代謝［34］。研究者在MPC的開發(fā)中也借鑒了此類3D結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)。目前最常使用的方法是向骨水泥配方中加入具備一定粒徑的可溶性惰性成孔劑，利用成孔劑與MPC之間的溶解度差異制造孔隙結(jié)構(gòu)?？扇苄远栊猿煽讋┑膬?yōu)點(diǎn)在于成本較低且孔隙大小易于控制，但在孔隙比例和孔隙分布上具有一定的隨機(jī)性，過多的孔隙及其在骨水泥內(nèi)部的非均勻排列會(huì)導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度的過度損失，尋找合適的平衡點(diǎn)仍是一個(gè)難題。Wei等［35］將不同粒徑氯化鈉晶體作為成孔劑分別制備了微孔及大孔MPC，以探究孔隙大小對(duì)MPC機(jī)械強(qiáng)度和生物學(xué)性能的影響，結(jié)果顯示大孔MPC組的體外降解速率高于微孔組，MG63細(xì)胞的黏附、增殖、分化率及堿性磷酸酶活性均高于微孔組，同時(shí)兔股骨髁缺損模型也驗(yàn)證了以上結(jié)論，大孔MPC組植入3個(gè)月后的缺損區(qū)域新生骨面積顯著增加。提高生物相容性的代價(jià)是大孔MPC組的機(jī)械強(qiáng)度損失，平均抗壓強(qiáng)度僅為8.62 Mpa，遠(yuǎn)低于皮質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度，難以滿足臨床需求。

3.4 新型可吸收椎間融合器 脊柱退行性病變保守治療效果不佳后常選擇脊柱融合作為治療方法。近年來椎間融合器在脊柱外科中廣泛使用，椎間融合器不僅可以提高融合椎體間的穩(wěn)定性，還可以在限制移植骨活動(dòng)范圍的同時(shí)恢復(fù)椎間隙高度和體積，降低椎間盤內(nèi)壓力、減少疼痛事件的發(fā)生［36］。為解決當(dāng)前椎間融合器存在的應(yīng)力遮擋、不可吸收等問題，韓振川等［37］設(shè)計(jì)了一種MPC椎間融合器，并將已廣泛應(yīng)用于臨床的聚醚醚酮椎間融合器作為對(duì)照組，結(jié)果表明MPC椎間融合器在承受相同外力時(shí)抵抗形變的能力明顯強(qiáng)于聚醚醚酮椎間融合器，這是由MPC椎間融合器與周圍組織化學(xué)鍵結(jié)合所致，MPC椎間融合器可兼具高機(jī)械強(qiáng)度和高體積穩(wěn)定性。MPC椎間融合器具備治療骨退行性病變的應(yīng)用前景，但是當(dāng)前缺少相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，有待進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

MPC是一種基于微溶鹽水化反應(yīng)生成的無機(jī)非金屬生物陶瓷材料，具有早期高強(qiáng)度、快速固化等特點(diǎn)，同時(shí)具有良好的生物相容性及生物降解性，因此近年來得到骨組織工程學(xué)研究者的重視。大量實(shí)驗(yàn)研究證明，MPC在具有滿足骨組織工程基礎(chǔ)機(jī)械性能的同時(shí)無細(xì)胞毒性及遺傳毒性，另外在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證明了MPC具有骨整合、骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)性能，可通過相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞/成骨細(xì)胞的增殖、分化與黏附，最終在骨缺損處通過生物降解誘導(dǎo)形成新骨替代。另外不同種類的改性物質(zhì)可加入MPC體系中，提高其物化性質(zhì)和生物相容性。此外，MPC在3D打印、載藥等方面也被成功應(yīng)用。但MPC相關(guān)研究也存在不足之處，如不同研究間的基礎(chǔ)配方差異較大，使用的細(xì)胞系及動(dòng)物模型不同，結(jié)果不具備橫向可比性，無法大規(guī)模量化評(píng)價(jià)MPC體系的整體性能。同時(shí)MPC研究水平尚不深入，分子機(jī)制水平的研究較少。