霉菌酵母快速檢測測試片的優(yōu)化

賈倩倩，李宏鐸，白福軍，于宏雙，張 靜，周 琦，賈 晨*

（1.北京美正生物科技有限公司，北京，102200；2.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安 710054；3.中儲(chǔ)糧承德糧油質(zhì)監(jiān)中心有限公司，河北承德 067000；4.雨潤集團(tuán)馬鞍山百瑞食品有限公司，安徽馬鞍山 243100）

霉菌和酵母使用廣泛，與人們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系十分密切。霉菌不僅應(yīng)用于傳統(tǒng)的釀酒制醬和發(fā)酵食品中，在農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥和皮革制造等領(lǐng)域都有極為重要的作用[1-3]。霉菌和酵母菌的污染會(huì)導(dǎo)致食品營養(yǎng)價(jià)值下降，甚至腐敗變質(zhì)。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，會(huì)造成腸胃不適，引發(fā)疾病[4]。因此，人們愈來愈重視食品中霉菌和酵母菌污染對人體造成的危害[5-6]。

霉菌和酵母菌的數(shù)量表明食品被污染的程度，是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量必不可少的指標(biāo)[7]。在我國飲料、堅(jiān)果制品、米面制品、糕點(diǎn)類等食品中，把霉菌和酵母菌作為食品污染的指示菌進(jìn)行監(jiān)測，被列入國標(biāo)GB 4789系列食品安全微生物常規(guī)檢測項(xiàng)目之一[8]。目前，國內(nèi)外對霉菌的檢查方法主要有平板計(jì)數(shù)法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法和測試片法［9-10］。其中，測試片法是一項(xiàng)微生物快速的檢測方法，該方法操作簡便，檢測時(shí)間短，極大地提高了檢測效率。而霉菌和酵母菌落在上呈不同形態(tài)，容易判斷觀察和直接計(jì)數(shù)。戴昌芳[11]、余淑冰[12]、王明[13]和趙紅陽[14]等將測試片與國標(biāo)方法檢測效果進(jìn)行了評價(jià)，研究結(jié)果表明兩種方法的檢出結(jié)果無顯著性差異。

測試片法雖然成本低、檢測性能好，但也存在霉菌菌絲的蔓延和顯色效果的不穩(wěn)定影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性等問題。因此，本研究同過添加不同濃度的抑制劑，探究其對霉菌和酵母菌落形態(tài)和顏色的影響，以此優(yōu)化霉酵測試片檢測效果。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

霉菌酵母測試片：北京美正生物科技有限公司；抑制劑與其他試劑均為國藥分析純試劑。實(shí)驗(yàn)中選取不同品牌和口味的糕點(diǎn)、面包、堅(jiān)果樣品共5種，均購自超市。標(biāo)準(zhǔn)菌株：1株酵母菌（10231）和11株霉菌（M-1 至 M-11）。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-80型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌液制備

從甘油管中活化酵母至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d，平板計(jì)數(shù)備用。

1.3.2 測試片培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)

將3株霉菌與酵母分別用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，振蕩器混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的稀釋液。分別添加霉菌抑制劑的濃度為 1 μL/L、2 μL/L、3 μL/L，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置兩個(gè)平行，分別吸取菌液1.0 mL接種于霉酵測試片上，培養(yǎng)測定酵母菌和霉菌的菌落總數(shù)，考察抑制劑濃度對霉菌和酵母菌落總數(shù)的影響。

1.3.3 測試片培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

（1）最佳計(jì)數(shù)范圍的測定。選用12株菌株，用無菌水稀釋成 1×10-7、2×10-7、4×10-7和 8×10-7CFU/mL的4個(gè)濃度梯度，進(jìn)行試驗(yàn)，分別吸取各個(gè)濃度梯度的菌懸液1.0 mL接種測試片，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

（2）食品樣品的檢測。從市場上采購不同品牌和口味的糕點(diǎn)、面包、堅(jiān)果和蜂蜜樣品共5份。稱取25 g/mL樣品放入盛有225 mL無菌水的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)器混勻，制成1∶10的樣品勻液。選取一株霉菌，做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。將霉菌進(jìn)行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，向樣品勻液中添加菌懸液，混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的加標(biāo)樣品，吸取的樣品菌懸液1.0 mL接種測試片，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.3.4 霉菌和酵母計(jì)數(shù)

培養(yǎng)后，酵母菌落較小，邊界清晰，顏色均一，菌落顯示紫紅色。霉菌菌落較大，邊緣模糊，呈淺粉色到紫紅色，顏色不均一。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)用SPSS、excel對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑對酵母與霉菌的生長率與形態(tài)的影響

由表1可知，隨著抑制劑濃度的升高，霉菌的菌落的生長率沒有顯著性差異，但霉菌菌落大小具有顯著差異，具體見圖1。與對照相比，添加抑制劑后霉菌菌落變??；當(dāng)抑制劑的濃度≥3 μL/L時(shí)，霉菌菌落的大小沒有顯著變化。同時(shí)，添加抑制劑對酵母的生長率和形態(tài)沒有顯著影響。因此，測試片添加抑制劑的濃度在2 μL/L時(shí)效果最佳。

表1 不同濃度抑制劑對霉菌和酵母生長率的影響（單位：log10 CFU/mL）

圖1 3株霉菌和1株酵母在測試片上的形態(tài)

2.2 測試片培養(yǎng)基準(zhǔn)確度測試結(jié)果

為了測定優(yōu)化后測試片的最佳計(jì)數(shù)范圍，使用12株菌株，濃度依次遞增，設(shè)置了4個(gè)梯度。由表2可知，優(yōu)化后的測試片，大部分霉菌的計(jì)數(shù)范圍在0～80 CFU，與對照霉菌計(jì)數(shù)范圍相比（計(jì)數(shù)范圍＜30 CFU），提高了50 CFU。當(dāng)菌落數(shù)大于86 CFU時(shí)，測試片結(jié)果顯示均不可計(jì)數(shù)。

表2 不同濃度梯度霉菌的菌落數(shù)（單位：CFU/mL）

2.3 食品樣品檢測結(jié)果

表3為檢測6種食品樣品的測試結(jié)果。其中，所有樣品原樣中均未檢出霉菌。加標(biāo)樣品檢測的結(jié)果表明，有5種食品樣品中檢出霉菌并計(jì)數(shù)，1個(gè)核桃樣品使測試片整體變色，不能計(jì)數(shù)。優(yōu)化后測試片霉菌的計(jì)數(shù)范圍明顯大于對照組，不同食品樣品的基質(zhì)會(huì)影響測試片霉酵的計(jì)數(shù)結(jié)果，但影響較小。因此，優(yōu)化后的測試片可以用于部分食品中霉菌菌落計(jì)數(shù)。

表3 各個(gè)食品樣品的霉菌生長率（單位：CFU/mL）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以霉菌酵母測試片為基礎(chǔ)，通過添加抑制劑探究對霉菌酵母生長率和形態(tài)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制劑能夠抑制霉菌菌絲蔓延，減小霉菌菌落，從而提高了霉酵測試片的計(jì)數(shù)范圍。在檢測面包、蜜餞和堅(jiān)果等食品樣品時(shí)，優(yōu)化后的測試片霉菌計(jì)數(shù)范圍明顯大于對照組。因此，優(yōu)化后的霉酵測試片能夠滿足食品樣品中的霉菌酵母計(jì)數(shù)的快速檢測需求。